膽汁淤積性肝硬化大鼠模型的改良

宣 佶，田耀洲，曹 鵬，胡春萍，蔡雪婷，張 偉

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；2．解放軍81醫(yī)院，江蘇 南京 210002；3．江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210002；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210002；5. 中國中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院，江蘇 南京 210002)

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，阻斷肝纖維化是慢性肝病治療中的關(guān)鍵問題[1]。為了更好地研究肝纖維化的發(fā)生機(jī)制以及藥物對該病的療效和治療途徑，需要建立穩(wěn)定、高效、可靠的肝纖維化動物模型[2,3]。國內(nèi)文獻(xiàn)對膽總管結(jié)扎模型建立的手術(shù)操作過程描述過于簡單，不利于模型的復(fù)制，同時關(guān)于其造模成功率僅做了短期內(nèi)的統(tǒng)計和評價，無法反映動物模型的遠(yuǎn)期可靠及穩(wěn)定性[3-5,7]，為此，筆者在研究膽汁淤積性肝硬化的藥物治療中，曾先后兩次建立膽汁淤積性肝硬化大鼠模型，本文擬報告造模過程，并探討一種方法簡便、成功率高、存活時間長、切實(shí)可行的造模方法。

1 膽總管結(jié)扎法

1.1 材料

清潔級SD大鼠40只由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，合格證號SCXK(滬)2007-0005；使用證號SYXK(蘇)2011-0017，雄性，體重(180±20)g，購于南京青龍山動物繁殖場。

1.2 方法

SD雄性成熟大鼠40只，隨機(jī)分為膽總管模型組(n=30)和假手術(shù)組(n=10)，禁食禁水24 h。進(jìn)行稱重，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，腹腔注射麻醉，仰位固定于固定板上，消毒切口，沿腹部正中線大鼠劍突以下約1．5～2 cm之間切口，打開腹腔，找到胃幽門部，翻轉(zhuǎn)十二指腸，在十二指腸周圍有淡粉色類似脂肪的就是胰腺；將胰腺展開后在胰腺中仔細(xì)尋找透明的管狀物，該導(dǎo)管是從肝臟發(fā)出最后走行進(jìn)入十二指腸，內(nèi)有淡黃色液體，即為膽管。膽總管模型組暴露膽總管，于膽總管中段雙重結(jié)扎，查腹腔內(nèi)無活動性出血后，常規(guī)關(guān)腹(圖1)。假手術(shù)組僅暴露膽總管，不予結(jié)扎，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素40萬U/只，禁水12 h，禁食24 h后正常喂養(yǎng)。術(shù)后1周眼眶取血檢測血清學(xué)指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、白蛋白/球蛋白(A/G)，術(shù)后4周取膽總管結(jié)扎和假手術(shù)小鼠肝組織塊常規(guī)石臘切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察；取肝組織塊經(jīng)SP法免疫組織化學(xué)染色。石臘切片經(jīng)梯度乙醇脫水，甲醇過氧化氫封閉后，分別用抗α-SMA mAb和抗CK-19 mAb 37℃孵育1 h，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠的二抗，37℃孵育0.5 h，二氨基聯(lián)苯胺顯色。用PBS代替一抗做為陰性對照。計算機(jī)掃描分析蛋白的陽性數(shù)目、灰度值和相對光密度。

1.3 結(jié)果

膽總管模型組大鼠術(shù)后尿黃，大便呈陶土色，但正常喂養(yǎng)后，膽總管模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，腹脹腹水明顯，術(shù)后14 d隨機(jī)其中5只大鼠，抽取腹水以AMS酶法測定腹水淀粉酶，提示腹水淀粉酶明顯升高(表1)，假手術(shù)組大鼠術(shù)后無精神萎靡，無腹水，毛發(fā)有光澤，進(jìn)食進(jìn)水正常，大小便正常，體重逐日增加。一周眼眶取血行血清學(xué)指標(biāo) (AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT) 檢測，對比假手術(shù)組模型組大鼠血清膽紅素明顯增高，肝功能異常(表2)，提示梗阻性黃疸模型成功，但是術(shù)后模型組相繼出現(xiàn)死亡，1月內(nèi)累計死亡20只，死亡率達(dá)66.7%，剖檢尸體發(fā)現(xiàn)胰腺壞死，大量腹水，腸道脹氣明顯。術(shù)后4周進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，膽總管模型組病理提示散在炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)小膽管明顯增生，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示，模型組肝臟匯管區(qū)小膽管周圍可見CK-19陽性的棕褐色細(xì)胞明顯增生,肝組織α-SMA陽性的棕褐色細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞大量增生(圖2，見封三)，膽總管模型組CK-19、α-SMA蛋白的陽性數(shù)目、灰度值和相對光密度表達(dá)水平升高(表3)。

2 肝門部肝總管縫扎法

2.1 材料

清潔級SD大鼠40只，雄性，體重(180±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，購于南京青龍山動物繁殖場,合格證號:SCXK(滬)2007-005；使用證號SYXK(蘇)2011-0017。

2.2 方法

SD雄性成熟大鼠40只，隨機(jī)分為肝總管模型組(n=30)和假手術(shù)組(n=10)，禁食禁水24 h。進(jìn)行稱重，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，腹腔注射麻醉，仰位固定于固定板上，消毒切口，沿腹部正中線大鼠劍突以下約1.5～2 cm之間切口，打開腹腔，暴露膽總管，沿膽總管向上找到肝門部，見此處無胰腺組織，拉鉤充分暴露術(shù)野，于肝總管近肝門部以5-0絲線單純縫扎，查腹腔內(nèi)無活動性出血后，常規(guī)關(guān)腹(圖1)。假手術(shù)組僅暴露肝總管，不予結(jié)扎，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素40萬U/只，禁水24 h，禁食48 h后正常喂水，少量喂食，1周后正常喂養(yǎng)。術(shù)后1周眼眶取血行血清學(xué)指標(biāo)(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT、A/G)檢測，術(shù)后4周取膽總管結(jié)扎和假手術(shù)小鼠肝組織塊常規(guī)石臘切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察；取肝組織塊經(jīng)SP法免疫組織化學(xué)染色,方法同上。

2.3 結(jié)果

肝總管模型組大鼠術(shù)后尿黃，大便呈陶土色，正常喂養(yǎng)后，無精神萎靡，一般情況良好，近期并無腹水腹脹等情況，假手術(shù)組大鼠術(shù)后無精神萎靡，毛發(fā)有光澤，進(jìn)食進(jìn)水正常，大小便正常，體重逐日增加。術(shù)后一周眼眶取血行血清學(xué)指標(biāo)(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT)檢測，對比假手術(shù)組模型組大鼠血清膽紅素明顯增高，肝功能異常，提示梗阻性黃疸模型成功，14 d后部分大鼠出現(xiàn)少量腹水，查腹水淀粉酶未見異常(表1),1月內(nèi)累計死亡8只，死亡率達(dá)26.7%。術(shù)后4周進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，肝總管模型組病理提示散在炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)小膽管明顯增生，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示，模型組肝臟匯管區(qū)小膽管周圍可見CK-19陽性的棕褐色細(xì)胞明顯增生,肝組織α-SMA陽性的棕褐色細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞大量增生(圖2見封三)，肝總管模型組CK-19、α-SMA蛋白的陽性數(shù)目、灰度值和相對光密度表達(dá)水平升高(表3)。

表1 腹水淀粉酶測定

表2肝功能生化指標(biāo)

Tab.2Biochemical indices of liver function

注：與假手術(shù)組比，* P<0.05；與膽總管模型組相比，# P > 0.05

表3 各組大鼠肝組織CK-19、α-SMA免疫組化染色的表達(dá)水平

3 討論

肝纖維化動物模型在肝纖維化的發(fā)生機(jī)制以及藥物研究中應(yīng)用廣泛，方法多樣，膽總管結(jié)扎術(shù)是其中一種經(jīng)典造模方法，該模型的原理與發(fā)生在人體的繼發(fā)性膽源性肝硬化的機(jī)制相吻合，形成人為的肝外膽道梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力增高，并可引發(fā)肝內(nèi)膽小管擴(kuò)張破裂[5,6]，國內(nèi)文獻(xiàn)報道該模型短期內(nèi)存活率在75%～83.3%之間[3-5,7]，但筆者發(fā)現(xiàn)該經(jīng)典方法造模后模型動物1月內(nèi)死亡率仍然偏高，很難滿足實(shí)驗(yàn)藥物療效觀察。

筆者第一次造模，采用經(jīng)典的結(jié)扎膽總管法，死亡率較高，成本較大。觀察發(fā)現(xiàn)模型大鼠術(shù)后當(dāng)天一般情況可，并無死亡，術(shù)后第二天進(jìn)食進(jìn)水后，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、腹部膨隆等情況，并且逐日加重，3 d后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，期間抽取腹水查淀粉酶提示明顯增高，剖檢死亡大鼠發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)大量腹水，胰腺液化壞死，腸道明顯脹氣。結(jié)合大鼠體征、血液及腹水生化及剖檢結(jié)果，分析大鼠死亡原因考慮為急性胰腺炎可能性較大，進(jìn)而導(dǎo)致腹水淀粉酶明顯升高，剖檢時發(fā)現(xiàn)腸道脹氣也與胰腺炎引起的麻痹性腸梗阻有關(guān)。通過仔細(xì)研究大鼠膽道解剖及胰腺分布，發(fā)現(xiàn)大鼠膽總管于胰腺內(nèi)走行，且管腔十分纖細(xì)，不易尋找和暴露，術(shù)中對胰腺中膽管的牽拉、分離解剖、結(jié)扎都不可避免的造成一定的胰腺損傷，加之術(shù)后過早喂食，促進(jìn)胰腺分泌，進(jìn)一步加重胰腺壞死，最終造成模型動物死亡。因此，筆者對第一次造模死亡率偏高主要原因總結(jié)為術(shù)中胰腺損傷和術(shù)后過早喂食刺激并加重胰腺壞死有關(guān)。

經(jīng)過仔細(xì)研究大鼠解剖結(jié)構(gòu)，筆者發(fā)現(xiàn)大鼠的肝總管位于左右肝管匯合部遠(yuǎn)心端，位置固定，易于尋找及暴露，且無胰腺組織包裹，于此處結(jié)扎膽道既可以有效阻斷膽道又可以減少損傷胰腺風(fēng)險。因此第二次以肝門部肝總管縫扎法進(jìn)行造模，以眼科針穿5-0絲線(盡量減少周圍組織損傷)進(jìn)行單純縫扎，術(shù)中小心操作，最大限度的減少分離、結(jié)扎膽管造成的牽拉，避免損傷胰腺組織，造模后適當(dāng)推遲給水喂食時間，推遲并減少胰腺分泌。術(shù)后發(fā)現(xiàn)肝總管模型組的大鼠給食后無精神萎靡，一般情況良好，1周內(nèi)并無腹部膨隆飽脹等情況，術(shù)后第二周部分大鼠出現(xiàn)少量腹水，查腹水淀粉酶未見異常，考慮與肝硬化后影響蛋白合成有關(guān)造成的腹水有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中, 各組大鼠血液生化提示兩個模型組大鼠較假手術(shù)組膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)明顯升高并伴有蛋白合成障礙；HE染色結(jié)果顯示散在炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)小膽管明顯增生，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)，同時我們利用膽管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志-細(xì)胞角蛋白19 (CK-19)免疫組化染色提示,膽管上皮細(xì)胞明顯增生。以上結(jié)果均反映出兩組模型組大鼠肝臟功能受損、細(xì)胞炎性反應(yīng)、小膽管細(xì)胞增生明顯等一系列病理表現(xiàn)。另外，肝纖維化的顯著特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的增加和成分的改變，而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化和增殖是其關(guān)鍵和中心環(huán)節(jié)[8-10]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是肝星狀細(xì)胞活化的特征性標(biāo)志物，免疫組化顯示兩組模型組大鼠肝臟α-SMA陽性細(xì)胞明顯增加，提示成纖維細(xì)胞大量增生，進(jìn)一步證實(shí)膽道結(jié)扎后大鼠肝臟纖維化的病理改變。

因此本研究表明對于以上兩種造模方法均可以有效制造膽汁淤積性肝硬化動物模型，但是前者死亡率較高，因此往往需要多次補(bǔ)做模型，時間和經(jīng)費(fèi)成本相對較大，而肝門部肝總管縫扎法，具有解剖位置固定、易于尋找和暴露、術(shù)后并發(fā)胰腺炎可能性小、成模率高、存活時間長等優(yōu)點(diǎn)，是一種切實(shí)、方便、可行的造模方法。筆者通過實(shí)驗(yàn)成功建立了膽汁淤積性肝硬化大鼠模型，對經(jīng)典的膽總管結(jié)扎造模方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，降低了造模的死亡率，提高了肝纖維化模型質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)效率。

參考文獻(xiàn)：

[1] Iredale JP．Models of liver fibrosis：exploirng the dynamic nature of inflammation and repair in a solid organ [J]．J Clin Invest, 2007, 117(3):539-548．

[2] Weiler-Normann C，herkel J，Lohse AW．Mouse models of liver fibrosis [J]．Z Gastroentero1, 2007, 45(1):43-50．

[3] 秦冬梅, 趙文惠, 胡利萍, 等. 膽總管結(jié)扎術(shù)造大鼠肝纖維化模型的研究 [J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2012, (04):27-29.

[4] 邵文武, 張輝. 膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立 [J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué). 2010, 33(4):102.

[5] 林冬靜, 金政. 常用肝纖維化動物模型的研究及評價 [J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2006, (03):189-190.

[6] Marques TG, Chaib E, Fonseca JH, et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection [J]. Acta Cir Bras, 2012, 27(8):589-594．

[7] 元海成, 秦鳴放, 鄒富勝，等. 大鼠膽總管結(jié)扎后不同時間點(diǎn)的生化指標(biāo)變化 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志， 2011, 17(6):583-585.

[8] Lee UE, Scott L. Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2011, 25(2):195-206.

[9] Kisseleva T, Brenner DA. Mechanisms of fibrogenesis [J]. Exp Biol Med, 2008, 233(2):109-22.

[10] Henderson NC, Iredale JP. Liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and resolution [J]. Clin Sci, 2007, 112:265-80.