高脂血癥長爪沙鼠模型的轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)和代謝性炎癥通路的初步研究

劉月環(huán)，毛棟森，吳舊生，鐘宇森，周莎桑，金曉音，柯賢福，應(yīng)華忠

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

高脂血癥是由脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或幾種脂質(zhì)高于正常的癥狀。流行病學(xué)調(diào)查表明，高脂血癥是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病、胰腺炎、癌癥等多種疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[1]。2002年全國第四次營養(yǎng)調(diào)查研究覆蓋了全國31個(gè)省市，根據(jù)調(diào)查的數(shù)據(jù)估計(jì)，全國血脂異常的人群約1.6億[2]，由此可見，探索發(fā)病機(jī)理，研究高脂血癥防治措施和篩選有效治療藥物是今后的一項(xiàng)長期工作。理想動(dòng)物模型是研究工作獲得重要進(jìn)展的關(guān)鍵之一[3]，目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室使用較多的動(dòng)物是大、小鼠，已有許多證據(jù)表明，大鼠和小鼠血清脂蛋白構(gòu)成、分布和體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程與人類存在較大差距，不能真實(shí)反映人的脂代謝狀態(tài)，且對(duì)高膽固醇不敏感。猴、豬、狗等大型動(dòng)物病變與人類相似，但成本高、來源困難、造模時(shí)間較長。兔是膽固醇敏感動(dòng)物，但其血清高密度脂蛋白比例過高，形成病變時(shí)間較長等，其使用受到限制。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型為血脂代謝和藥物評(píng)價(jià)提供了全新的實(shí)驗(yàn)體系，但人類脂代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化的形成是多基因所致，很難歸咎于單基因異常，同時(shí)由于傳代后遺傳性狀的穩(wěn)定性，價(jià)格昂貴等系列原因使其未能成為常用的高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型[4]。

自上個(gè)世紀(jì)六十年代以來，國內(nèi)外學(xué)者以高脂飼料誘發(fā)的長爪沙鼠高脂血癥的研究，結(jié)果表明該動(dòng)物以其成模時(shí)間短(只需要四周)、性狀典型(與人類高脂血癥極為相似)、飼料配方簡(jiǎn)便(不需要甲狀腺抑制藥物)而著稱[5-6]，但其遺傳基礎(chǔ)一直不明。為查明該問題，篩選培育高脂血癥長爪沙鼠新品系的遺傳標(biāo)記，筆者自2005年以來建立了長爪沙鼠高脂飲食的高脂血癥模型[7]，用候選基因法對(duì)APOE、LCAT兩個(gè)基因的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在Z：ZCLA封閉群長爪沙鼠大群體中LCAT呈單態(tài)，而在ApoE基因發(fā)現(xiàn)了三個(gè)SNP，用這三個(gè)SNP對(duì)ZCLA兩個(gè)微生物等級(jí)封閉群進(jìn)行了相應(yīng)的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳效應(yīng)的分析評(píng)價(jià)后，認(rèn)為這三個(gè)SNP對(duì)于封閉繁育了30多年的ZCLA群體來說標(biāo)記偏少，基因頻率偏低，于是我們引入新興的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，闡明與高脂血癥相關(guān)的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)及基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)在群體水平上對(duì)該基因的遺傳力進(jìn)行評(píng)價(jià)，期望盡快找到可利用的主效基因，防止ZCLA群體優(yōu)良基因的進(jìn)一步丟失，加快篩選遺傳標(biāo)記的進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)用長爪沙鼠由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK(浙)2008-0034，SYXK(浙)2008-0114，商品化飼料參照GB14923-2010生產(chǎn))。配合高脂飼料，選取90日齡長爪沙鼠(雌、雄性鼠兼用)60只，分為正常組(n=30)及模型組(n=30)，體重(50～70)g，正常組飼喂基礎(chǔ)飼料，而模型組則飼喂基礎(chǔ)料70.5%(各成份的配比及生產(chǎn)按照GB14924-2001執(zhí)行)、豬油7%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉7%。造模型四周時(shí)取血清測(cè)定甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHO/TC)、低密度脂蛋白(LDL/LIP)、高密度脂蛋白(HDL)，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行四周，處死前進(jìn)行CO2麻醉，大體解剖觀察肝臟形態(tài)，有明顯脂沉積者取作轉(zhuǎn)錄組RNA制備的樣本，兩組動(dòng)物分別組成兩個(gè)RNA樣本池。

RNA-Seq 測(cè)序cDNA 文庫制備采用Illumina Satandard Kit 及QIA quick PCR purification KIT 試劑盒(Qiagen)試劑盒，具體操作按照說明書進(jìn)行，測(cè)序在浙江大學(xué)納米研究院(Illumina GA IIx 測(cè)序平臺(tái))。

1.2 RNA-Seq文庫的制備，read質(zhì)量的預(yù)處理及Unigene的de novo拼接

按照說明書，用Poly(T)寡聚核苷酸從上述2個(gè)總RNA池(正常組與模型組，每池取20 μg)中抽取帶 poly(A)尾的RNA，70℃溫度下裂解5 min，將其隨機(jī)打斷成片段。利用N6隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶將片段化的mRNA 合成cDNA 一鏈，繼而合成雙鏈cDNA，然后對(duì)二鏈cDNA 進(jìn)行末端修飾將其連接到Illumina 雙端測(cè)序接頭上(adapter)，用于測(cè)序的cDNA 再經(jīng)過15個(gè)循環(huán)的PCR 線性擴(kuò)增后經(jīng)富集和純化得到最終的cDNA 文庫。利用 通過Solexa RNA的paired-end測(cè)序進(jìn)行5’ 和3’ 雙向RNA-Seq 測(cè)序，每個(gè)泳道產(chǎn)生數(shù)百萬條Read(樣本數(shù)據(jù))。鑒于Solexa數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率對(duì)結(jié)果的影響，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理(即用滑動(dòng)窗口法去除低質(zhì)量片段，窗口長度為5 bp，長度閾值35 bp，質(zhì)量閾值20(錯(cuò)誤率=1%)大小。將長爪沙鼠2組樣本的測(cè)序reads合并進(jìn)行de novo拼接，使用軟件velvet_1.0.19，paired-end的拼接方法，得到許多unigene。

1.3 與公共數(shù)據(jù)庫的BLAST及基因的KEGG注釋與GO注釋

將拼接樣本unigene與公共數(shù)據(jù)gene進(jìn)行比較，通過gene的同源性進(jìn)行功能注釋?；蛳嗨票葘?duì)主要是使用基因Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)算法[8]。樣本基因序列，分別與SWISS-PROT、CDD、PFAM、NR和TREMBL庫進(jìn)行比對(duì)，取相似度>30%，且e<1e-5的注釋。利用WEGO對(duì)得到的基因進(jìn)行g(shù)ene ontology ( GO )分類[9-10]，統(tǒng)計(jì)基因在Biological Process, Cellular Component, Molecular Function 三個(gè)類別的各GO term。進(jìn)行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway分析[11]，此分析是基于預(yù)測(cè)得到ORF序列，利用KAAS預(yù)測(cè)得到對(duì)應(yīng)的KO號(hào)，然后利用KO號(hào)對(duì)應(yīng)到KEGG pathway上，分析基因與KEGG中酶注釋的關(guān)系文件以及映射到pathway的信息。

1.4 計(jì)算長爪沙鼠基因表達(dá)豐度

用拼接得到的47 522個(gè)沙鼠基因做庫，用序列相似性比對(duì)的方法求各基因在各樣本中的表達(dá)豐度。使用軟件bowtie 0.12.7，single-end的mapping方法，允許一個(gè)reads比對(duì)到多個(gè)基因上(-v 3-a—phred64-quals)?；虮磉_(dá)估計(jì)方法用RPKM來表示，即以每個(gè)基因單位長度序列數(shù)的RPKM 值(reads per kilobase of exon model per million mapped reads)來衡量，就是每百萬讀段中來自于某基因外顯子每千堿基長度的讀段數(shù)，公式如下：

1.5 差異表達(dá)基因分析及其GO和KEGG富集分析

應(yīng)用DEGseq 程序包比較2個(gè)文庫中差異基因表達(dá)的情況[12]，根據(jù)各樣本基因的表達(dá)豐度值(FPKM)做基因的差異表達(dá)分析，包括：fold change分析，fisher檢驗(yàn)，chisq檢驗(yàn)等差異表達(dá)分析。對(duì)于以上各方法得到的差異基因，以fold change結(jié)果為準(zhǔn)。將差異基因作為前景基因，全部基因作為背景基因，進(jìn)行GO和KEGG的富集分析，使用超幾何分布算法(phyper)計(jì)算前景基因同GO/Pathway分類中某個(gè)特定分支的P值，并用FDR進(jìn)行校正。

1.6 Q-PCR的驗(yàn)證

提取純化的總RNA，檢測(cè)28 s 和18 s 質(zhì)量合格后，挑選10個(gè)差異倍數(shù)大于2的差異基因，設(shè)計(jì)引物，引物在上海睿迪生物公司合成。各目的基因引物序列以及退火溫度見表1。用普通PCR 方法對(duì)每個(gè)目的基因和持家基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，以確定每個(gè)基因擴(kuò)增的特異性。在每板反應(yīng)結(jié)束后，所有引物擴(kuò)增系列均擬制溶解曲線，每個(gè)溶解曲線均只存在一個(gè)峰值，表明熒光定量PCR 擴(kuò)增過程特異性較好，無非特異性擴(kuò)增，這和前面普通PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果一致。實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果采用2-ΔΔCt方法來表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用配對(duì)T 檢驗(yàn)法(Paired-Samples T Test)分析高脂血癥對(duì)長爪沙鼠基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)表示方式為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E)。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的Q-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的注釋

RNA-seq數(shù)據(jù)共6.68千萬條，平均長度94.63 bp，測(cè)序樣本均base滿足2G要求，De novo拼接后最終得到了有效鼠基因47 522個(gè)(即≥100 bp的unigene),大小26.9 Mb；約82.53%序列為比對(duì)到基因組上外顯子的序列; 其中長于1 000 bp的unigene有8 015個(gè)(表2)。

表2 拼接結(jié)果

2.2 基因表達(dá)差異及顯著性的分析

對(duì)得到的基因注釋分析是基于BLAST UniProt的結(jié)果 ( 即合并與Swiss-Prot和trEMBL的結(jié)果 )，Blast能夠?qū)崿F(xiàn)比較兩段核酸或者蛋白序列之間的同源性的功能，它能夠快速的找到兩段序列之間的同源序列并對(duì)比對(duì)區(qū)域進(jìn)行打分以確定同源性的高低。利用得到的uniprot號(hào)比對(duì)GO term，拼接基因得到的所有注釋，詳細(xì)信息注釋上NR、SWISS-PROT、CDD、PFAM、TREMBL庫的基因分別有51.43%、49.20%、 50.93%、 32.65%、44.19%。

在level2的基礎(chǔ)將5 365個(gè)GO分別按照分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)和細(xì)胞成分(cellular component, CC)進(jìn)行分類，以上三種方法的分類信息分別含有 621個(gè)GO (13.2%)、1 989個(gè)GO (37.1%)和706個(gè)GO (11.6%)，剩下的為沒有任何分類信息的基因。GO主要是信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氨基酸代謝、維生素合成與代謝，能量代謝、膽固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程、甘油三酯代謝過程、脂質(zhì)分解過程、脂肪細(xì)胞分化、脂肪酸分解過程、甘油三酯生物合成過程、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)信號(hào)通路、胰島素受體信號(hào)通路、膽固醇平衡、細(xì)胞因子形成等 (P<0.001)。 共有12 914個(gè)基因注釋到282個(gè)pathway，其中包括1 004個(gè)酶，表3列示了注釋上基因最多的5個(gè)pathway，圖1(見彩插4)列示了長爪沙鼠unigene注釋到ko00010(其中紅色表示注釋上的基因)。

表3 長爪沙鼠unigene注釋上基因最多的5個(gè)pathway

2.4 Q-PCR驗(yàn)證

以肝臟組織cDNA 作為模板，對(duì)模板進(jìn)行 10倍濃度梯度稀釋，以優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，得到各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值都大于0.980，且各基因的擴(kuò)增效率都處于95%～105% 之間，目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率都接近100%，且它們之間擴(kuò)增效率相對(duì)偏差不超過5%，可以用于熒光定量PCR分析(圖2)。

圖2 七個(gè)基因Q-PCR驗(yàn)證的結(jié)果

使用2倍上調(diào)/下調(diào)的fold change閾值統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，本研究中，誘發(fā)高脂血癥與正常動(dòng)物之間共獲得21 125 差異基因，16 087個(gè)下調(diào)，5 038個(gè)上調(diào)，總體上模型組相對(duì)于正常組存在較顯著的趨勢(shì)性下調(diào)關(guān)系。

2.5 與炎癥通路相關(guān)的基因及其表達(dá)量

共有8個(gè)通路[13]與長爪沙鼠高脂血癥代謝性炎癥密切相關(guān)(P<0.01)，分別是ECM受體的相互作用途徑(ko04512)、細(xì)胞粘附分子途徑 (ko04514)、細(xì)胞因子受體相互作用 (ko04060)、粘著 (ko04514/04510)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移 (ko04670)、趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 (ko04062)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián) (ko04610)與抗原處理與演示 (ko04612)，其余通路(如JAK-STAT信號(hào)通路 (ko04630)、MAPK信號(hào)通路(ko04010)、Toll樣受體信號(hào)通路(ko04620)、B細(xì)胞受體信號(hào)通路(ko04662)、急性髓細(xì)胞白血病(ko05221)、溶酶體(ko04142)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子(ko02010)等均未達(dá)顯著水平。對(duì)照組是實(shí)驗(yàn)組2倍以上的基因有LAMA1(層粘連蛋白)、LAMA2(層粘連蛋白)、ITGB3(整合，β3(Ⅲa的血小板膜糖蛋白CD61抗原))、MHC I (主要組織相容性復(fù)合體)、MHC II(主要組織相容性復(fù)合體)、CLDN5(緊密連接5)、PTPRC(蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶，受體類型C)、CD58(CD58分子)、PTPRC(細(xì) 胞 粘 附 分 子 途 徑)、EPOR(細(xì)胞因子細(xì)胞因子受體相互作用途徑)、PPPICB(蛋白磷酸酶1催化亞基，β同工酶)、ACTB(肌動(dòng)蛋白，β)、JUN(c-Jun蛋白)，XCR1(趨化因子(C模式)受體1)和CR1(補(bǔ)體受體I型)。15個(gè)與免疫和炎癥相關(guān)的基因表達(dá)均顯著下調(diào)，其中JUN表達(dá)下調(diào)五倍，EPOR(促紅細(xì)胞生長素受體)，XCR1(趨化因子(C模式)受體1)，CR1(補(bǔ)體受體1型)下調(diào)超過3倍。

3 討論

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是生物體最主要的調(diào)控方式，而RNA-Seq 技術(shù)最基本的應(yīng)用也是檢測(cè)基因的表達(dá)水平，它對(duì)同一樣品深度測(cè)序可以捕獲低表達(dá)的基因，而對(duì)大量樣品同時(shí)測(cè)序可以獲得樣品之間的表達(dá)差異[14]。Mortazavi等[15]利用Solexa 技術(shù)進(jìn)行了小鼠的4種不同組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，他們發(fā)現(xiàn)有90%的序列比對(duì)上基因組上的外顯子區(qū)域，剩下的10%序列比對(duì)上的區(qū)域可能是未知的一些轉(zhuǎn)錄區(qū)域。Pan 等[16]利用Solexa 測(cè)序儀進(jìn)行了人的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，首次利用新一代測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)了選擇性剪切。對(duì)于高脂血癥這樣的多基因疾病，弄清疾病發(fā)作期病變器官(如肝臟)高表達(dá)的基因，全面地評(píng)價(jià)模型，或篩選出高脂血癥的主基因或高效應(yīng)SNP標(biāo)記，培育高脂血癥的新品系，具有十分重要而現(xiàn)實(shí)的科學(xué)意義。

代謝性炎癥是由于攝入營養(yǎng)物和代謝過剩而觸發(fā)炎癥的過程，是一種低程度的系統(tǒng)性炎癥。在長期的進(jìn)化過程中,各種生物都形成了代謝和免疫反應(yīng)的公共通路，也可以說機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和病原體形成相同的感應(yīng)系統(tǒng)，營養(yǎng)物質(zhì)的攝入與病原體的入侵一樣，除可引起代謝系統(tǒng)的反應(yīng)外，還可像病原體一樣誘發(fā)免疫系統(tǒng)的紊亂[17]。它涉及與經(jīng)典炎癥類似的分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也可造成多種炎性分子的表達(dá)和活性增強(qiáng)，而且這種炎癥可以持續(xù)長期存在，在造成相關(guān)器官形態(tài)和功能損傷的基礎(chǔ)上對(duì)機(jī)體的生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[18]。Lee等[19]利用基因芯片檢測(cè)了印度肥胖和非肥胖患者腹部脂肪組織細(xì)胞基因表達(dá)差異情況，結(jié)果表明，肥胖患者腹部脂肪細(xì)胞中大量與炎癥和免疫相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，其中52個(gè)表達(dá)上調(diào)，2個(gè)表達(dá)下調(diào)。這些基因中包括如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(C1QTNF5)、白介素1(IL-1B)和巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)等。Xie等[20]用高脂飼喂Wistar大鼠16周后誘發(fā)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，用基因芯片檢測(cè)到了130多個(gè)基因上調(diào)，而涉及炎癥的PPAR通路下調(diào)。在本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的8個(gè)通路中15個(gè)與免疫和炎癥相關(guān)的基因表達(dá)均顯著下調(diào)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病機(jī)制理論“二次打擊學(xué)說”[21]認(rèn)為，一次打擊誘發(fā)脂肪變性，隨后在應(yīng)激產(chǎn)生的細(xì)胞因子、持續(xù)存在的原有致病因素、肝星狀細(xì)胞活化等作用下發(fā)生二次打擊，導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥、壞死、細(xì)胞凋亡以及纖維化等。據(jù)此推測(cè)飲食誘導(dǎo)的高脂血癥長爪沙鼠模型在造模型四周中存在兩種可能，一種是處在一次打擊期內(nèi)，主要通過促使外周脂肪分解增加和胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪堆積，所以機(jī)體表現(xiàn)只有高脂血癥，肝臟脂肪變性，沒有發(fā)生炎癥[22]，還有一種可能是發(fā)生了輕微的炎癥，由于機(jī)體組織適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制的抗氧化、抗細(xì)胞調(diào)亡、瘦素的抗脂肪毒性等防御功能可與上述因素相抗衡繼而機(jī)體自行修復(fù)[23]，其過程大致是，首先與炎癥相關(guān)的受體和信號(hào)通路增強(qiáng)如ECM受體的相互作用和趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞間粘附因子增多如細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、粘著等下調(diào)，然后炎癥發(fā)生過程的相關(guān)代謝如白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、抗原處理和演示、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)也下調(diào)，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組長爪沙鼠肝臟因高脂血癥發(fā)生炎癥反應(yīng)，繼而發(fā)生抑制炎癥與組織修復(fù)[24]。

本研究獲得的上述差異基因與關(guān)鍵通路的功能需要繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，具體可以通過構(gòu)建基因敲除或沉默載體來創(chuàng)建基因缺陷型細(xì)胞系(或動(dòng)物模型)，既可以進(jìn)行單靶點(diǎn)操作，也可以多靶點(diǎn)操作，還可以利用轉(zhuǎn)錄組海量數(shù)據(jù)篩選出可用的微衛(wèi)星標(biāo)記，鑒定有功能的SNP，進(jìn)而發(fā)展成為培育近交系的遺傳標(biāo)記。另外，由于在真核生物中，選擇性剪切現(xiàn)象普遍存在，選擇性剪接方式不同產(chǎn)生的功能基因不同，基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA 前體(pre-mRNA)過程中可形成不同的剪切異構(gòu)體和基因表達(dá)，可能會(huì)對(duì)高脂血癥的表型影響不同，因此尋找新的轉(zhuǎn)錄本和剪接方式也成為今后的研究主要方向之一。

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