磁共振示蹤法定量測(cè)量大鼠C6膠質(zhì)瘤模型細(xì)胞外間隙擴(kuò)散參數(shù)

左 龍，趙 越，李懷業(yè),李 凱,盧嘉賓，韓鴻賓

(1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科，北京 100191; 2.磁共振裝備與技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100191; 3.大連大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，大連116622; 4.北京積水潭醫(yī)院放射科，北京 100035)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占惡性腦腫瘤的81%[1]。膠質(zhì)瘤通常會(huì)導(dǎo)致顯著的致殘率和死亡率。在過去的幾十年中，治療方法不斷改進(jìn)。目前，放療聯(lián)合化療是手術(shù)后的一線輔助治療[2]。然而，幾乎所有的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在7～10個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存期中位期后都會(huì)出現(xiàn)病情進(jìn)展[3]。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤總體上難治且預(yù)后差。實(shí)際上大多數(shù)化療藥物不能通過血腦屏障，因而藥物到達(dá)腫瘤靶點(diǎn)的效率低下[4]。研究人員相繼發(fā)明了諸多新的治療策略，其中局部給藥可以直接繞過血腦屏障。局部給藥具體包括，局部注射、對(duì)流增強(qiáng)給藥和各種埋置多聚物。局部給藥可以將高生物利用度的制劑直接作用于靶點(diǎn)，而且?guī)缀鯖]有藥物損耗[5]。然而，溶液回流和水腫等多種副作用阻礙了對(duì)流增強(qiáng)給藥(CED)發(fā)展成一個(gè)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療系統(tǒng)[6].

為克服上述缺陷，人們建立了一種磁共振實(shí)時(shí)成像的方法來(lái)監(jiān)測(cè)給藥過程[7-9]，但卻沒有定量計(jì)算局部擴(kuò)散和清除參數(shù)。本課題組首先應(yīng)用磁共振示蹤技術(shù)定量測(cè)量了正常大鼠腦尾狀核、丘腦、枕葉皮質(zhì)和黑質(zhì)的擴(kuò)散和清除參數(shù)[10，11]。本研究首次應(yīng)用磁共振示蹤技術(shù)定量比較了C6膠質(zhì)瘤10 d模型和20 d模型擴(kuò)散和清除參數(shù)的差異，并且對(duì)影響擴(kuò)散和清除的細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)行了免疫組化和蛋白質(zhì)印跡分析比較。

1 材料和方法

1.1 溶液制備和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用雙蒸水稀釋釓二乙三胺五乙酸 (Gd-DTPA，馬根維顯，拜耳先靈制藥，德國(guó)) 至10 mmol/L。本研究方案獲得了北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批號(hào) No. LA2012-016)。16 只成年雄性 SD 大鼠，清潔級(jí)，體重(250～300)g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK( 京) 2011-0012。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(字)2011-0039。隨機(jī)分為兩組： 10 d膠質(zhì)瘤組(n=8)和20 d膠質(zhì)瘤組(n=8)。C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(ATCC No. CCL 107) 培養(yǎng)如以往報(bào)道。大鼠(n=8)經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉、乙醇、水合氯醛、硫酸鎂和丙二醇混合物(3 mL/kg)麻醉后，固定于立體定位儀(Stoelting, 美國(guó))。在頭皮沿矢狀縫從兩耳間區(qū)域至兩眼間區(qū)域做正中切口，小心分離腦膜暴露前囟。右側(cè)顱骨表面定位鉆孔 (前囟前，1 mm；右旁開，3.5 mm)。C6細(xì)胞懸液(5 ×106cells in 10 μL)經(jīng)顱骨孔緩慢注入(10 min)右側(cè)尾狀核 (前囟前，1 mm；右旁開，3.5 mm；深，5.0 mm)。微量進(jìn)樣器停針5 min。顱骨孔用骨蠟封閉，頭皮縫合。

1.2 MRI示蹤法示蹤大鼠C6膠質(zhì)瘤模型細(xì)胞外間隙擴(kuò)散

大鼠麻醉如前所述，實(shí)驗(yàn)過程中適時(shí)追加保持麻醉狀態(tài)(約為 0.7 mL/kg/h)。大鼠置于加熱墊(38 ± 0.5)°C上保持體溫。預(yù)掃描將大鼠置于西門子磁共振成像(Magnetom Trio，Germany)系統(tǒng)腕線圈中, 用 T1 加權(quán)三維磁化準(zhǔn)備快速采集梯度回波序列(T1 3D MP-RAGE)掃描[12]。獲得用于圖像后處理的預(yù)掃描圖像并用于確定穿刺位點(diǎn)。大鼠顱頂備皮，碘伏消毒。沿矢狀縫從兩耳間區(qū)域至兩眼間區(qū)域開頭皮，小心分離腦膜暴露前囟。將大鼠置于立體定位儀上, 根據(jù) MRI 預(yù)掃描結(jié)果顯示的腫瘤生長(zhǎng)情況在顱骨表面重新定位鉆孔，向腫瘤中心區(qū)域微量注射10 mmol/L Gd-DTPA 溶液 2 μL(注射時(shí)間 10 min)。注射 Gd-DTPA 后不同時(shí)間點(diǎn),15min、30 min、第1、2、3、4、5、6小時(shí)行磁共振掃描成像。成像序列和參數(shù)如前所述。

1.3 圖像后處理和參數(shù)計(jì)算

用 MATLAB7.8 軟件(MathWork, 美國(guó))將注射后掃描圖像與預(yù)掃描圖像配準(zhǔn)后獲得減影圖像[13]。本課題組前期研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3.0T磁共振機(jī)應(yīng)用T1加權(quán)3D MP-RAGE序列掃描的Gd-DTPA濃度與信號(hào)強(qiáng)度增量(ΔSI)的線性關(guān)系[12]。與以往的1/T1值與Gd-DTPA濃度關(guān)系相比更有利于實(shí)時(shí)成像計(jì)算[14-16]。MRI示蹤法定量細(xì)胞外間隙擴(kuò)散的主要參數(shù)包括自由擴(kuò)散系數(shù) (D)，有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)，迂曲度 (λ)和清除速率常數(shù)(k’). 根據(jù)本課題組已經(jīng)報(bào)道的方法進(jìn)行參數(shù)計(jì)算[17]。為測(cè)量腦組織間液流動(dòng)參數(shù)半衰期(thalf-life)，將高于背景噪音兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的的信號(hào)強(qiáng)度作為閾值，逐層提取感興趣區(qū)內(nèi)的所有像素得到各掃描時(shí)間點(diǎn)Gd-DTPA總量(Gdsum)。由于Gd-DTPA在腦內(nèi)按一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)清除，Gd-DTPA的半衰期可以通過曲線擬合得到(Gdsum=e-kt)，其中半衰期(thalf-life)根據(jù)thalf-life=ln(2/k)進(jìn)行計(jì)算。

1.4 免疫組化

選取典型的細(xì)胞外基質(zhì)大分子進(jìn)行免疫組化分析[18-20]。5 μm石蠟切片脫蠟后，3%過氧化氫避光浸泡，抗原熱修復(fù)。分別滴加抗硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C、IV型膠原蛋白一抗(兔抗大鼠；1∶200；博奧森)，4℃過夜；加二抗常溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)

將上述大分子用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測(cè)[21-23]。腫瘤組織取材，加入裂解液勻漿后離心，各取上清液50 μg點(diǎn)樣于12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶封閉。分別用硫酸軟骨素蛋白多糖抗體、腱生蛋白C抗體、抗IV型膠原蛋白(兔抗大鼠；1∶1 000；博奧森)或抗GAPDH(1∶10 000; 博奧森) 4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑( enhanced chemiluminescence，ECL)，X光膠片曝光，ImageJ軟件(國(guó)立衛(wèi)生院，美國(guó))分析。以GAPDH蛋白作為系統(tǒng)內(nèi)參，測(cè)定條帶進(jìn)行灰度值，以目的/內(nèi)參比值來(lái)比較表達(dá)的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件19.0版本進(jìn)行 (IBM，美國(guó))。所有結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式表示。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組樣本的有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)，迂曲度(λ)，清除速率常數(shù)(k’)和半衰期(thalf-life)。用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較兩組樣本的蛋白印跡分析。P值小于0.05(P<0.05)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤10d模型和膠質(zhì)瘤20 d模型Gd-DTPA擴(kuò)散參數(shù)和半衰期的比較

MRI矢狀位、橫軸位和冠狀位三個(gè)方向顯示不同時(shí)間點(diǎn)Gd-DTPA的擴(kuò)散過程(圖1和2); Gd-DTPA導(dǎo)入細(xì)胞外間隙后，局部信號(hào)強(qiáng)度增高，隨后信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間衰減至示蹤劑從細(xì)胞外間隙中清除。20 d膠質(zhì)瘤有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)明顯小于10 d膠質(zhì)瘤((6.67±1.78) ×10-5mm2/s vs. (1.26±0.27) ×10-4mm2/s; t=4.265;P<0.01)，導(dǎo)致迂曲度(λ)增大 (λ=(D/D*)1/2)((3.99±0.57) vs. (2.83±0.29);t=4.11;P<0.01) (圖3A)。測(cè)量清除速率常數(shù)(k’)，20 d膠質(zhì)瘤((7.67±2.29) ×10-5mm2/s) 小于10 d膠質(zhì)瘤 ((1.46±0.36) ×10-4mm2/s)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.87;P<0.05)(圖3A)。10d膠質(zhì)瘤半衰期(0.86±0.23 h)顯著小于20 d膠質(zhì)瘤(1.64±0.12 h) (t=5.91;P<0.01)(圖3B)。

注1：(A)矢狀位；(B)橫軸位；(C)冠狀位

注2：(A)矢狀位；(B)橫軸位；(C)冠狀位。

2.2 膠質(zhì)瘤10 d模型和20 d模型細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的差異

注3：(A)擴(kuò)散參數(shù)定量分析(D*,λ,k’) (B)Gd-DTPA的半衰期擬合曲線圖。(C)膠質(zhì)瘤10 d模型半衰期與膠質(zhì)瘤20 d模型半衰期統(tǒng)計(jì)分析(thalf-life)，** P<0.01。

為了更好地理解上述擴(kuò)散參數(shù)(D*, λ 和k’)和半衰期(thalf-life)的差異，我們用免疫組化法觀察到20 d膠質(zhì)瘤中硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的表達(dá)(圖4B, 4D和4F)均較10 d膠質(zhì)瘤的表達(dá)(圖 4A, 4C和4E，圖4見封三)增高。Western blotting的定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs/GAPDH)(圖 5A)在20 d膠質(zhì)瘤中(0.48±0.07)的表達(dá)均高于在10 d膠質(zhì)瘤中(0.32±0.09)的表達(dá)(t=4.663；P<0.01)，腱生蛋白C(Tenascin-C/GAPDH)亦然((0.29±0.04)vs.(0.58±0.11)；t=6.50;P<0.01)(圖5B)。20 d膠質(zhì)瘤中IV型膠原蛋白(collagen IV/GAPDH)(圖5C)的含量也高于10 d膠質(zhì)瘤((0.24±0.07)vs.(0.33±0.06)；t=3.81；P<0.05)。

3 討論

眾所周知，磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion-weighted MRI)是一種能夠測(cè)量組織內(nèi)水分子擴(kuò)散的成像技術(shù)，是腦腫瘤分級(jí)和判斷放化療療效方面的研究熱點(diǎn)[24-27]。但是由于擴(kuò)散加權(quán)成像并不能區(qū)分細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的擴(kuò)散且空間分辨力低，因而難以用于指導(dǎo)腦內(nèi)局部給藥[28]，實(shí)時(shí)磁共振示蹤技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

本研究應(yīng)用磁共振示蹤法定量研究了膠質(zhì)瘤模型在生長(zhǎng)的第10天和第20天腫瘤細(xì)胞外間隙的有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)，清除速率常數(shù)(k’)和半衰期(thalf-life)等方面表現(xiàn)出了顯著的差異。這兩個(gè)時(shí)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞外擴(kuò)散和清除的所具有的不同特征與膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)的不同相關(guān)。20 d膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分如硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的增多，與20 d膠質(zhì)瘤有效擴(kuò)散系數(shù)、清除速率常數(shù)的較小和半衰期的延長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)。

注5：(A) 硫酸軟骨素蛋白多糖Western blot分析；(B) 腱生蛋白C Western blot分析；(C) IV型膠原蛋白Westernblot分析；** P<0.01,* P<0.05.

通常，腫瘤體積的增大是腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志[29]。腫瘤細(xì)胞植入后，腫瘤體積隨時(shí)間逐漸增大，即為腫瘤進(jìn)展[30]。腫瘤細(xì)胞外間隙的擴(kuò)散對(duì)于腫瘤細(xì)胞攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，和抗腫瘤藥物到達(dá)治療靶點(diǎn)作用于腫瘤都至關(guān)重要[31]。細(xì)胞外基質(zhì)成分是影響腦腫瘤細(xì)胞外間隙擴(kuò)散的重要因素之一[32， 33]，可以增加細(xì)胞外間隙粘滯度，降低擴(kuò)散速率[34]。細(xì)胞外基質(zhì)的存在增加了分子運(yùn)動(dòng)的粘滯阻力，使細(xì)胞外間隙不再是自由擴(kuò)散介質(zhì)[35]。以往文獻(xiàn)報(bào)道，硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞外間隙中高表達(dá)，并隨著腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展含量逐漸升高[22， 36-40]。本研究的結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。腦細(xì)胞外間隙占腦容積的20%，腦細(xì)胞間約50 nm的空隙內(nèi)含細(xì)胞外基質(zhì)[41， 42]。目前認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分可降低溶質(zhì)分子或膜相關(guān)分子的擴(kuò)散[34]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)分子種類較多，主要包括蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維等成分[43]。本研究中的硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白分別是上述三種主要成分的典型代表分子，在ECS中含量較高，參與構(gòu)成膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，并影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，而受到廣泛關(guān)注[36]。另外由于幾種成分之間往往相互連接構(gòu)成復(fù)合結(jié)構(gòu)[43]，所以選取典型細(xì)胞外基質(zhì)分子有助于對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞外間隙的分析。本研究局限性在于只是選取了典型的細(xì)胞外基質(zhì)分子，未來(lái)需要對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的各種分子對(duì)擴(kuò)散的影響進(jìn)行更全面的研究，并進(jìn)一步對(duì)不同類型膠質(zhì)瘤擴(kuò)散參數(shù)和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定量研究。

腫瘤分期是腫瘤學(xué)研究的基本內(nèi)容之一。國(guó)際抗癌聯(lián)盟 (UICC) 美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC) 的TNM分期系統(tǒng)[44]是五十多年來(lái)評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的參考[45]。但是自第五版以來(lái)，TNM分期已不再包含原發(fā)性腦腫瘤的內(nèi)容[44]。目前使用的是世界衛(wèi)生組織(WHO)分類標(biāo)準(zhǔn)，將原發(fā)性腦腫瘤分為星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤和混合型膠質(zhì)瘤[46]。有學(xué)者認(rèn)為將腫瘤體積、浸潤(rùn)情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等考慮在內(nèi)可將腫瘤進(jìn)一步分期[47]，并認(rèn)為T分期(腫瘤大小)是制定各期神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療方案的重要參考[48]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)時(shí)期的膠質(zhì)瘤擴(kuò)散參數(shù)明顯不同，提示局部給藥參數(shù)應(yīng)根據(jù)腫瘤進(jìn)展情況進(jìn)行調(diào)整。

局部給藥是治療惡性膠質(zhì)瘤的新方法和新希望。實(shí)時(shí)MRI示蹤技術(shù)將有助于我們更好地研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞外間隙擴(kuò)散的生物學(xué)基礎(chǔ)，有助于惡性膠質(zhì)瘤局部治療的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ostrom QT, Bauchet L, Davis FG, et al. The epidemiology of glioma in adults: a “state of the science” review[J]. Neuro Oncol, 2014, 16(7):896-913.

[2] Omuro A, Deangelis LM. Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review[J]. JAMA, 2013, 310(17): 1842-1850.

[3] Omuro AM, Faivre S, Raymond E. Lessons learned in the development of targeted therapy for malignant gliomas[J]. Mol Cancer Ther, 2007, 6(7): 1909-1919.

[4] Neuwelt EA. Mechanisms of disease: the blood-brain barrier[J]. Neurosurgery, 2004, 54(1): 131-40; discussion 141-142.

[5] Allhenn D, Boushehri MA, Lamprecht A. Drug delivery strategies for the treatment of malignant gliomas[J]. Int J Pharm, 2012, 436(1-2): 299-310.

[6] Jagannathan J, Walbridge S, Butman JA, et al. Effect of ependymal and pial surfaces on convection-enhanced delivery[J]. J Neurosurg, 2008, 109(3): 547-552.

[7] Krauze MT, Vandenberg SR, Yamashita Y, et al. Safety of real-time convection-enhanced delivery of liposomes to primate brain: a long-term retrospective[J]. Exp Neurol, 2008, 210(2): 638-644.

[8] Heiss JD, Walbridge S, Asthagiri AR, et al. Image-guided convection-enhanced delivery of muscimol to the primate brain[J]. J Neurosurg, 2010, 112(4): 790-795.

[9] Sampson JH, Brady M, Raghavan R, et al. Colocalization of gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acid with high-molecular-weight molecules after intracerebral convection-enhanced delivery in humans[J]. Neurosurgery, 2011, 69(3): 668-676.

[10] Han H, Shi C, Fu Y, et al. A novel MRI tracer-based method for measuring water diffusion in the extracellular space of the rat brain[J]. IEEE J Biomed Health Inform, 2014, 18(3): 978-983.

[11] Han H, Li K, Yan J, et al. An in vivo study with an MRI tracer method reveals the biophysical properties of interstitial fluid in the rat brain[J]. Sci China Life Sci, 2012, 55(9): 782-787.

[12] Xu F, Han H, Zhang H, et al. Quantification of Gd-DTPA concentration in neuroimaging using T(1)3D MP-RAGE sequence at 3.0 T[J]. Magn Reson Imaging, 2011, 29(6): 827-834.

[13] Liu B, Bai XZ, Zhou FG, et al. Mutual information based three-dimensional registration of rat rain magnetic resonance imaging time-series[J]. Comput Electr Engineer, 2013, 39(5): 1473-1484.

[14] Brady M, Raghavan R, Chen ZJ, et al. Quantifying fluid infusions and tissue expansion in brain[J]. IEEE Trans Biomed Eng, 2011, 58(8): 2228-2237.

[15] Tweedle MF, Wedeking P, Telser J, et al. Dependence of MR signal intensity on Gd tissue concentration over a broad dose range[J]. Magn Reson Med, 1991, 22(2): 191-4; discussion 195-196.

[16] Morkenborg J, Pedersen M, Jensen FT, et al. Quantitative assessment of Gd-DTPA contrast agent from signal enhancement: an in-vitro study[J]. Magn Reson Imaging, 2003, 21(6): 637-43.

[17] Li K, Han H, Zhu K, et al. Real-time magnetic resonance imaging visualization and quantitative assessment of diffusion in the cerebral extracellular space of C6 glioma-bearing rats[J]. Neurosci Lett, 2013, 543: 84-89.

[18] Matsuoka K, Matsuzaka K, Yoshinari M, et al. Tenascin-C promotes differentiation of rat dental pulp cells in vitro[J]. Int Endod J, 2013, 46(1): 30-9.

[19] Flynn E R, Marbury DC, Sawyer RT, et al. Amlodipine reduces inflammation despite promoting albuminuria in the streptozotocin-induced diabetic rat[J]. Nephron Extra, 2012, 2(1): 205-218.

[20] Miyata S, Shinga I, Taguchi K, et al. Chondroitin sulfate proteoglycan phosphacan/RPTPbeta in the hypothalamic magnocellular nuclei[J]. Brain Res, 2002, 949(1-2): 112-121.

[21] Abe T, Mori T, Kohno K, et al. Expression of 72 kDa type IV collagenase and invasion activity of human glioma cells[J]. Clin Exp Metast, 1994, 12(4): 296-304.

[22] Sim H, Hu B, Viapiano MS. Reduced expression of the hyaluronan and proteoglycan link proteins in malignant gliomas[J]. J Biol Chem, 2009, 284(39): 26547-2656.

[23] Fujimoto M, Suzuki H, Shiba M, et al. Tenascin-C induces prolonged constriction of cerebral arteries in rats[J]. Neurobiol Dis, 2013, 55: 104-109.

[24] Chu HH, Choi SH, Ryoo I, et al. Differentiation of true progression from pseudoprogression in glioblastoma treated with radiation therapy and concomitant temozolomide: comparison study of standard and high-b-value diffusion-weighted imaging[J]. Radiology, 2013, 269(3): 831-840.

[25] Kang Y, Choi SH, Kim YJ, et al. Gliomas: histogram analysis of apparent diffusion coefficient maps with standard- or high-b-value diffusion-weighted MR imaging—correlation with tumor grade[J]. Radiology, 2011, 261(3): 882-890.

[26] Castillo M, Smith JK, Kwock L, et al. Apparent diffusion coefficients in the evaluation of high-grade cerebral gliomas[J]. AJNR Am J Neuroradiol, 2001, 22(1): 60-64.

[27] Murakami R, Hirai T, Sugahara T, et al. Grading astrocytic tumors by using apparent diffusion coefficient parameters: superiority of a one- versus two-parameter pilot method[J]. Radiology, 2009, 251(3): 838-845.

[28] Vorisek I, Sykova E. Measuring diffusion parameters in the brain: comparing the real-time iontophoretic method and diffusion-weighted magnetic resonance[J]. Acta Physiol (Oxf), 2009, 195(1): 101-110.

[29] Zhai H, Heppner FL, Tsirka SE. Microglia/macrophages promote glioma progression[J]. Glia, 2011, 59(3): 472-485.

[30] Beljebbar A, Dukic S, Amharref N, et al. Monitoring of biochemical changes through the c6 gliomas progression and invasion by Fourier transform infrared (FTIR) imaging[J]. Anal Chem, 2009, 81(22): 9247-9256.

[31] Netti PA, Hamberg LM, Babich JW, et al. Enhancement of fluid filtration across tumor vessels: implication for delivery of macromolecules[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(6): 3137-3142.

[32] Vargova L, Homola A, Zamecnik J, et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas[J]. Glia, 2003, 42(1): 77-88.

[33] Pluen A, Boucher Y, Ramanujan S, et al. Role of tumor-host interactions in interstitial diffusion of macromolecules: cranial vs. subcutaneous tumors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(8): 4628-4633.

[34] Dityatev A, Seidenbecher CI, Schachner M. Compartmentalization from the outside: the extracellular matrix and functional microdomains in the brain[J]. Trends Neurosci, 2010, 33(11): 503-512.

[35] Sykova E, Nicholson C. Diffusion in brain extracellular space[J]. Physiol Rev, 2008, 88(4): 1277-1340.

[36] Zamecnik J. The extracellular space and matrix of gliomas[J]. Acta Neuropathol, 2005, 110(5): 435-442.

[37] Alvarez-Dolado M, Gonzalez-Sancho JM, Navarro-Yubero C, et al. Retinoic acid and 1,25-dihydroxyvitamin D3 inhibit tenascin-C expression in rat glioma C6 cells[J]. J Neurosci Res, 1999, 58(2): 293-300.

[38] Herold-Mende C, Mueller MM, Bonsanto MM, et al. Clinical impact and functional aspects of tenascin-C expression during glioma progression[J]. Int J Cancer, 2002, 98(3): 362-369.

[39] Mammoto T, Jiang A, Jiang E, et al. Role of collagen matrix in tumor angiogenesis and glioblastoma multiforme progression[J]. Am J Pathol, 2013, 183(4): 1293-1305.

[40] Noreen R, Chien CC, Chen HH, et al. FTIR spectro-imaging of collagen scaffold formation during glioma tumor development[J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405(27): 8729-8736.

[41] Verkman AS. Diffusion in the extracellular space in brain and tumors[J]. Phys Biol, 2013, 10(4): 045003.

[42] Nicholson C, Sykova E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis[J]. Trends Neurosci, 1998, 21(5): 207-215.

[43] Gladson CL. The extracellular matrix of gliomas: modulation of cell function[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 1999, 58(10): 1029-1040.

[44] Cuccurullo V, Mansi L. AJCC Cancer Staging Handbook: from the AJCC Cancer Staging Manual (7th edition)[J]. E JNucl Med Mol Imag, 2011, 38(2): 408-408.

[45] Webber C, Gospodarowicz M, Sobin LH, et al. Improving the TNM classification: findings from a 10-year continuous literature review[J]. Int J Cancer, 2014, 135(2):371-378.

[46] Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[J]. Acta Neuropathol, 2007, 114(2): 97-109.

[47] Jovcevska I, Kocevar N, Komel R. Glioma and glioblastoma - how much do we (not) know?[J]. Mol Clin Oncol, 2013, 1(6): 935-941.

[48] Zimmerman RA. Imaging of adult central nervous system primary malignant gliomas. Staging and follow-up[J]. Cancer, 1991, 67(4 Suppl): 1278-1283.