厚樸酚延緩幼年自發(fā)性高血壓大鼠的高血壓進(jìn)程及其機(jī)制*

梁向艷， 邢文娟， 何金孝， 季樂樂， 李 榕， 張海鋒△

(第四軍醫(yī)大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，3西京醫(yī)院兒科， 4西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032)

高血壓前期是指收縮壓處于120～139 mmHg或舒張壓處于80～89 mmHg的血壓階段，我國高血壓防治指南稱之為“正常高值”血壓。美國和我國的流行病學(xué)調(diào)查均顯示，高血壓前期人群較血壓正常人群更易發(fā)展為高血壓[1-2]，即使沒有發(fā)展為高血壓，高血壓前期人群也增加了其它心血管疾病尤其是中風(fēng)的危險(xiǎn)[3]。已報(bào)道在高血壓前期應(yīng)用坎地沙坦可減少高血壓的發(fā)病率[2]，我們最近證實(shí)在高血壓前期長期運(yùn)動(dòng)鍛煉可以延緩高血壓進(jìn)程[4]。因此在高血壓前期進(jìn)行干預(yù)處理來延緩血壓升高是確實(shí)可行的。然而高血壓前期發(fā)展為高血壓的潛在機(jī)制仍不清楚，在高血壓前期抗高血壓治療的藥物仍然缺乏。

厚樸酚(magnolol, MAG)是中藥厚樸的活性成分，具有活血化瘀的功效，在心血管系統(tǒng)的作用主要包括減輕缺血/再灌注損傷和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用等[5-8]，但其對血壓的影響仍不清楚。我們前期研究證實(shí)，幼年血壓正常的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats, SHR)對胰島素誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)降低[9-10]，而運(yùn)動(dòng)鍛煉可通過改善血管胰島素抵抗來降低血壓[4]。有研究證實(shí)Tribbles 同源蛋白3 (Tribbles homologue 3, TRB3)可通過抑制Akt磷酸化來減弱胰島素信號通路[11]。此外，過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)激活可增強(qiáng)胰島素信號通路[12]，且自發(fā)性高血壓大鼠血管組織表達(dá)降低，收縮壓升高[13]。厚樸酚在體外能激活PPARγ[14]，然而其在體內(nèi)能否影響PPARγ和TRB3的表達(dá)仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究厚樸酚對高血壓前期大鼠血壓和胰島素誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)的影響，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

厚樸酚(陜西旭煌植物科技發(fā)展有限公司)；wortmannin(Santa Cruz)；PPARγ、TRB3、Akt、p-Akt、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和p-eNOS抗體(Cell Signaling)；其它試劑均購自Sigma；羅氏活力型血糖儀及血糖試紙(Roche)；大鼠胰島素ELISA試劑盒(R&D)；一氧化氮(nitric oxide， NO)檢測試劑盒(南京建成)；生物信號采集與處理系統(tǒng)、無創(chuàng)血壓分析儀(成都泰盟公司)；電泳儀(Bio -Rad)。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

采用4周齡的雄性SHR及年齡、性別匹配的正常血壓Wistar-Kyoto(WKY)大鼠。共分為4組：① WKY對照組：每日灌胃蒸餾水;② WKY+MAG處理組：每日灌胃MAG(100 mg/kg);③ SHR對照組：每日灌胃蒸餾水;④ SHR+ MAG處理組：每日灌胃MAG(100 mg/kg)。3周后，大鼠禁食12 h，測量尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure,SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure ,DBP)，檢測胰島素水平和血糖水平。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1血壓、血液指標(biāo)的測定 大鼠血壓檢測采用無創(chuàng)尾套法測量尾動(dòng)脈收縮壓和舒張壓。3周后取腔靜脈血離心，測量血漿胰島素水平和空腹血糖水平。血糖濃度使用血糖分析儀檢測，血漿胰島素濃度采用放射免疫法檢測。

3.2血管環(huán)實(shí)驗(yàn) 大鼠麻醉后取降主動(dòng)脈于冰冷的Kreb’s液中。剔除結(jié)締組織將其剪成約3 mm的血管環(huán)并垂直懸掛于含37 ℃的Kreb’s液的浴槽中，通含95% O2和5% CO2的混合氣?；A(chǔ)張力為1×g，平衡90 min,每15 min換液。血管穩(wěn)定后以10-6mol/L的苯腎上腺素(phenylephrine，PE)收縮血管，收縮達(dá)峰值后加入10-5mol/L 乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)。若加入ACh后使血管舒張70%～90%可認(rèn)為內(nèi)皮完整，否則棄用。沖洗穩(wěn)定30 min后重復(fù)給予PE，待血管收縮達(dá)到穩(wěn)定值后逐步加入胰島素(10-10～10-6mol/L)。以PE誘發(fā)的收縮幅度為100%，舒張率(%)=藥物引起舒張的張力/PE引起的收縮張力×100%。

3.3Western blotting檢測PPARγ、TRB3、Akt和eNOS的表達(dá)水平 常規(guī)方法提血管組織或細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，使用ECL-Plus試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，β-actin為各組內(nèi)參照。用Quantity One 4.0成像軟件系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度值分析。

3.4細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定為陽性；實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞純度在90%以上。傳代培養(yǎng)至2～4代后，以1×108/L的密度接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。隨機(jī)分為正常對照組：直接給予低糖DMEM培養(yǎng)液(5.6 mmol/L)；高糖高脂組：DMEM培養(yǎng)液中高糖濃度為25 mmol/L，棕櫚酸鈉濃度為500 μmol/L。每組8孔，培養(yǎng)48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MTT法測定細(xì)胞活性。

3.5NO含量檢測 培養(yǎng)基上清取100 μL，嚴(yán)格按南京建成NO檢測試劑盒操作，每組重復(fù)測量3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，運(yùn)用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或組間t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 厚樸酚對SHR/WKY大鼠血壓及其它生理參數(shù)的影響

大鼠飼養(yǎng)3周后，SHR的體重、血糖、血漿胰島素、舒張壓和收縮壓開始升高，且顯著高于WKY組。SHR組給予厚樸酚干預(yù)后，其血糖、血漿胰島素、舒張壓和收縮壓與對照組SHR相比顯著降低，見表1，圖1。

表1 WKY大鼠和SHR的生理參數(shù)

Figure 1. The effect of magnolol (MAG) on systolic blood pressure (A) and diastolic blood pressure (B) in the rats. Mean±SEM. n=8. **P<0.01 vs WKY; ##P<0.01 vs SHR.

2 厚樸酚對胰島素誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)的影響

如圖2A所示,SHR組大鼠的主動(dòng)脈血管對胰島素誘導(dǎo)的舒張效應(yīng)明顯低于WKY組，說明SHR大鼠血管胰島素敏感性顯著降低可能發(fā)生了血管胰島素抵抗。厚樸酚灌胃3周后SHR主動(dòng)脈血管對胰島素誘導(dǎo)的舒張效應(yīng)明顯高于未用藥的SHR組，說明厚樸酚具有增強(qiáng)SHR血管胰島素敏感性的作用，但用左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-niotro-L-arginine methyl ester,L-NAME)或去內(nèi)皮處理后該作用消失，見圖2D。此外，ACh和S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetyl penicillamine, SNAP)都能引起SHR和WKY大鼠主動(dòng)脈血管的舒張效應(yīng)，但它們引起的血管舒張效應(yīng)并沒有顯著差異，見圖2B～C，提示SHR組大鼠血管胰島素敏感性降低不是內(nèi)皮釋放NO功能或平滑肌舒張功能受損，而是其血管內(nèi)皮胰島素信號通路受損所致。

3 厚樸酚對血管PPARγ和TRB3的表達(dá)及胰島素Akt/eNOS信號通路的影響

如圖3所示，與WKY組相比，SHR組大鼠血管組織TRB3表達(dá)顯著增加，PPARγ表達(dá)無顯著變化，Akt和eNOS磷酸化顯著降低，而厚樸酚可顯著上調(diào)其血管組織PPARγ的表達(dá)水平及Akt、eNOS磷酸化水平，下調(diào)TRB3的表達(dá)。這些結(jié)果提示厚樸酚可能通過增加PPARγ表達(dá)及減少TRB3表達(dá)來增強(qiáng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而增強(qiáng)SHR血管胰島素敏感性。

Figure 2. Impairment of insulin-induced vasodilatation and the effect of magnolo(MAG)l on insulin-induced vasodilatation in aortic segments from rats.SNAP: S-nitroso-N-acetyl penicillamine; L-NAME: Nω-nitro-L-arginine methyl ester; E-: endothelium denudation. Mean±SEM. n=6. **P<0.01 vs WKY; #P<0.05, ##P<0.01 vs SHR; ??P<0.01 rs SHR+MAG.

4 厚樸酚對HUVECs 的PPARγ和TRB3表達(dá)及胰島素Akt/eNOS信號通路的影響

如圖4所示，HUVECs高糖高脂培養(yǎng)18 h，PPARγ的表達(dá)減少，TRB3的表達(dá)增加，磷酸化的Akt和eNOS顯著降低且NO釋放減少，但是厚樸酚孵育后改變了這些趨勢，最后增加了NO釋放。

5 PPARγ拮抗劑阻斷厚樸酚增加PPARγ表達(dá)及增敏胰島素對Akt/eNOS信號通路的作用

為更深研究，我們在高糖高脂培養(yǎng)的HUVECs中加入PPARγ拮抗劑雙酚丙烷二環(huán)氧丙醚(bisphenol adiglycidylether,BADGE)。如圖5所示，厚樸酚增加PPARγ的表達(dá)、減少TRB3的表達(dá)，增強(qiáng)Akt、eNOS磷酸化的作用被BADGE抑制。說明在HUVECs中厚樸酚減少TRB3表達(dá)、增敏胰島素的作用依賴于PPARγ的上調(diào)。

討 論

我國的“高血壓前期”發(fā)生率為41.3%，其人群10年后發(fā)生高血壓的比例高達(dá)52.6%，且發(fā)生高血壓相關(guān)的心血管事件及死于心血管疾病的概率較血壓正常者明顯升高，故在高血壓前期及早通過改善生活方式或預(yù)防用藥來防治高血壓是有意義的。厚樸酚是中藥厚樸的活性成分，具有活血化瘀的功效，在心血管系統(tǒng)的作用主要包括改善缺血/再灌注損傷和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，但是其對血壓的影響仍不清楚。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在高血壓前期給予厚樸酚干預(yù)可顯著降低其SBP和DBP，提示厚樸酚高血壓前期干預(yù)可延緩高血壓的進(jìn)程，這對預(yù)防高血壓具有臨床意義，特別是對那些可能發(fā)展為高血壓并出現(xiàn)心血管亞臨床病變的高血壓前期人群，就顯得尤其重要。

有一種假設(shè)認(rèn)為胰島素抵抗不僅是高血壓的臨床表現(xiàn)，而且是高血壓發(fā)展的一個(gè)因素。我們前期發(fā)現(xiàn)，在血壓正常的幼年SHR，胰島素誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)減弱，血管組織胰島素信號通路受損(PI3K/Akt/eNOS)、NO釋放減少[9-10]。提示，在高血壓前期已經(jīng)發(fā)生了血管胰島素抵抗，這可能是SHR胰島素抵抗促發(fā)外周血管功能障礙和高血壓的機(jī)制之一。本研究證實(shí)，從高血壓前期開始給予SHRs厚樸酚干預(yù)3周，可通過增加其血管胰島素敏感性來降低血壓，并且增強(qiáng)其主動(dòng)脈血管Akt和eNOS磷酸化；在HUVECs中厚樸酚可以減少高糖高脂誘導(dǎo)的胰島素敏感性受損，增強(qiáng)磷酸化Akt和eNOS表達(dá)、促進(jìn)NO釋放。因此，在高血壓前期給予厚樸酚干預(yù)來恢復(fù)胰島素信號通路可能參與了血管胰島素增敏和隨后的系統(tǒng)血壓降低。

Figure 3. The effects of MAG on PPARγ (A) and TRB3 (B) expression, and insulin-stimulated activation of Akt/eNOS (C and D) signaling pathway. Mean±SEM. n=5.*P<0.05 vs WKY; #P<0.05 vs SHR.

有研究表明，與年齡匹配的WKY大鼠相比，SHR血管組織PPARγ表達(dá)水平顯著下降，血壓顯著升高[13]，激活PPARγ可能對胰島素信號通路有關(guān)的重要基因產(chǎn)生直接作用[12]，而厚樸酚在體外可激活PPARγ[14]。我們證實(shí)用厚樸酚干預(yù)SHR3周，可增強(qiáng)PPARγ表達(dá)以及胰島素信號，并在高糖高脂培養(yǎng)的HUVECs中也觀察到此作用，而PPARγ阻斷劑抑制了這一作用。提示厚樸酚能夠修復(fù)下游受損的胰島素信號通路，即通過活化PPARγ來增加胰島素誘導(dǎo)的Akt和eNOS磷酸化。此外有研究證實(shí)TRB3可通過抑制Akt磷酸化對胰島素信號通路進(jìn)行負(fù)性調(diào)控[11, 15-16]。我們發(fā)現(xiàn)，PPARγ拮抗劑阻斷了厚樸酚降低TRB3表達(dá)的作用，提示厚樸酚可以作為一種PPARγ激動(dòng)劑，通過增強(qiáng)PPARγ表達(dá)與活化來抑制下游TRB3的表達(dá)并增加Akt和eNOS的活化來改善血管胰島素抵抗，最終降低血壓。

總之，本研究首次證實(shí)，在SHR高血壓前期給予厚樸酚干預(yù)可改善血管胰島素抵抗并延緩血壓升高，該作用與上調(diào)SHRs血管組織PPARγ表達(dá)、減少TRB3表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)Akt和eNOS活性有關(guān)。這些結(jié)果提示厚樸酚有望作為一種早期抗高血壓藥物在高血壓前期使用。

Figure 4. The effects of magnolol on PPARγ expression and insulin-stimulated activation of Akt/ eNOS/NO signaling in the HUVECs. Expression of PPARγ (A), TRB3 (B), p-Akt/Akt (C) and p-eNOS/eNOS (D), and release of NO (E) in the conditioned medium were measured. HG/HF: high glucose/high fat treatment. Mean±SEM. n=5～6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs HG/HF.

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Gupta AK, McGlone M, Greenway FL, et al. Prehypertension in disease-free adults: a marker for an adverse cardiometabolic risk profile[J]. Hypertens Res, 2010, 33(9):905-910.

[2] Julius S, Nesbitt SD, Egan BM, et al. Trial of preventing hypertension (TROPHY) study investigators. Feasibility of treating prehypertension with an angiotensin-receptor blocker[J]. N Engl J Med, 2006, 354(16):1685-1697.

[3] Huang Y, Su L, Cai X, et al. Association of all-cause and cardiovascular mortality with prehypertension: a meta-analysis[J]. Am Heart J, 2014, 167(2):160-168.

[4] Xing W, Li Y, Zhang H, et al. Improvement of vascular insulin sensitivity by downregulation of GRK2 mediates exercise-induced alleviation of hypertension in spontaneously hypertensive rats[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013, 305(8):H1111-H1119.

[5] Jin YC, Kim KJ, Kim YM, et al. Anti-apoptotic effect of magnolol in myocardial ischemia and reperfusion injury requires extracellular signal-regulated kinase1/2 pathways in ratinvivo[J]. Exp Biol Med, 2008, 233(10):1280-1288.

[6] Karki R, Ho OM, Kim DW. Magnolol attenuates neointima formation by inducing cell cycle arrest via inhibition of ERK1/2 and NF-κB activation in vascular smooth muscle cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(3):2619-2628.

[7] Karki R, Kim SB, Kim DW. Magnolol inhibits migration of vascular smooth muscle cells via cytoskeletal remodeling pathway to attenuate neointima formation[J]. Exp Cell Res, 2013, 319(20):3238-3250.

Figure 5. PPARγ antagonist blocked the effects of MAG on PPARγ expression and insulin-stimulated signaling in the HUVECs. Expression of PPARγ (A), TRB3 (B), p-Akt/Akt (C) and p-eNOS/eNOS (D) in the conditioned medium were measured. BADGE: PPARγ antagonist bisphenol adiglycidylether. Mean±SEM. n=5～6.*P<0.05 vs control; ?#P<0.05 vs HG/HF; △P<0.05 vs HG/HF+MAG.

[8] Kim GD, Oh J, Park HJ, et al. Magnolol inhibits angiogenesis by regulating ROS-mediated apoptosis and the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in mES/EB-derived endothelial-like cells[J]. Int J Oncol, 2013, 43(2):600-610.

[9] Xing W, Yan W, Liu P, et al. A novel mechanism for vascular insulin resistance in normotensive young SHRs: hypoadiponectinemia and resultant APPL1 downregulation[J]. Hypertension, 2013, 61(5):1028-1035.

[10] Li R, Zhang H, Wang W, et al. Vascular insulin resistance in prehypertensive rats: role of PI3-kinase/Akt/eNOS signaling[J]. Eur J Pharmacol, 2010, 628(1-3):140-147.

[11] Du K, Herzig S, Kulkarni RN, et al. TRB3: atribbleshomolog that inhibits Akt/PKB activation by insulin in liver[J]. Science, 2003, 300(5625):1574-1577.

[12] Zhang H, Li J, Li R, et al. Reduced cardiotropic response to insulin in spontaneously hypertensive rats: role of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-initiated signaling[J]. J Hypertens, 2008, 26(3):560-569.

[13] Wu L, Wang R, De Champlain J, et al. Beneficial and deleterious effects of rosiglitazone on hypertension development in spontaneously hypertensive rats[J]. Am J Hypertens, 2004, 17(9):749-756.

[14] Fakhrudin N, Ladurner A, Atanasov AG, et al. Compu-ter-aided discovery, validation, and mechanistic characte-rization of novel neolignan activators of peroxisome prolife-rator-activated receptor gamma[J]. Mol Pharmacol, 2010, 77(4):559-566.

[15] Ijuin T, Takenawa T. SKIP negatively regulates insulin-induced GLUT4 translocation and membrane ruffle formation[J]. Mol Cell Biol, 2003, 23(4):1209-1220.

[16] Prudente S, Hribal ML, Flex E, et al. The functional Q84R polymorphism of mammalian Tribbles homolog TRB3 is associated with insulin resistance and related cardiovascular risk in Caucasians from Italy[J]. Diabetes, 2005, 54(9):2807-2811.