小葉錦雞兒內(nèi)生拮抗菌株的篩選與分子鑒定

李志英+田岳娟+徐惠娟+代金霞

摘要：采用抑菌圈法對分離自寧夏荒漠草原固沙植物小葉錦雞兒的27株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病原菌抑制能力的測定。結(jié)果表明，小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，多數(shù)菌株對2種以上的病原菌表現(xiàn)出拮抗活性，且不同菌株之間以及同一菌株對不同病原菌間的拮抗活性存在很大差異，有7株內(nèi)生細(xì)菌對所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，小葉錦雞兒內(nèi)生拮抗菌株分別與芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、羅爾斯通氏菌屬、中華根瘤菌屬具有很高的同源性，這些菌株多數(shù)為芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：小葉錦雞兒；內(nèi)生菌；抑菌活性；分子鑒定

中圖分類號(hào)： Q939.92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0105-02

收稿日期：2013-09-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31200103）；寧夏自然科學(xué)基金（編號(hào)：NZ12152）。

作者簡介：李志英（1977—），女，寧夏青銅峽人，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail：lizhiying_1115@163.com。

通信作者：代金霞，女，寧夏銀川人，博士，副教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail：djxia05@163.com。植物內(nèi)生菌（endophyte）是指生長在健康植物組織、器官內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群[1]。植物內(nèi)生菌長期生存于植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化，一方面植物體為其提供生長所必需的能量和營養(yǎng)，另一方面，內(nèi)生菌又可以通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對植物體產(chǎn)生影響[2]。許多植物內(nèi)生細(xì)菌具有多方面的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能，如固氮、促進(jìn)植物生長、抗逆境、抗病蟲害和生物修復(fù)等。

植物病害是引起植物品質(zhì)下降、產(chǎn)量損失的主要原因之一，約80%的植物病害是由植物病原菌引起的。目前，對植物病害的主要防治手段是采用化學(xué)農(nóng)藥，而化學(xué)農(nóng)藥對人畜的副作用以及殘留問題、環(huán)境污染問題已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的主要問題。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生眾多的抗菌產(chǎn)物并在一定條件下成為植物病原菌的拮抗菌，卻不會(huì)引起宿主植物明顯的病癥，目前從植物體內(nèi)篩選對植物病原菌具有抑制作用的拮抗內(nèi)生菌并進(jìn)行生物防治已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3]。

小葉錦雞兒（Caragana microphylia Lam.）為豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物，具有廣泛的適應(yīng)性和極強(qiáng)的抗逆性，是中國西北、華北、東北西部水土保持和固沙造林的重要樹種之一。小葉錦雞兒在維護(hù)干旱荒漠區(qū)的生態(tài)平衡、改善沙區(qū)環(huán)境、發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)、提高沙區(qū)的經(jīng)濟(jì)效能中發(fā)揮著十分重要的作用[4]。

本試驗(yàn)通過對小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑制植物病原菌的能力進(jìn)行測定，試圖篩選出具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株并對其進(jìn)行分子鑒定。研究結(jié)果不僅可為開發(fā)生物農(nóng)藥提供菌種資源，同時(shí)也將為豐富我國的微生物資源、推動(dòng)干旱地區(qū)微生物資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株分離自寧夏荒漠固沙植物小葉錦雞兒的各部分組織中，根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)選取其中的27株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，菌種編號(hào)分別為：R05、R09、R10、R12、R14、R18、R41、R43、R44、R46、R47、R48、L01、L02、L05、L10、L12、L13、L15、L16、L17、L18、L19、L20、S01、S03、SD3。指示病原菌為：小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici）、番茄炭疽病菌（Colletotrichum lycopersici）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、馬鈴薯干腐病菌（Fusarium solani）、蘿卜黑斑病菌（Alternaria sp.），均來源于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室。

1.2內(nèi)生菌的分離與純化

各稱取1 g小葉錦雞兒的根、莖、葉，表面消毒后置于滅菌研缽中研磨；將磨碎的組織加到含有滅菌生理鹽水和滅菌玻璃珠的錐形瓶中，渦旋振蕩1 min；將上清液倒入滅菌離心管中沉淀后，再將上清液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋率分別為10-1、10-2、10-3，各取0.1 mL涂LB平板，每個(gè)處理重復(fù)3次；同時(shí)取0.1 mL最后一次沖洗的無菌水涂平板，作為表面滅菌對照。將所有平板于28 ℃培養(yǎng) 72 h，挑取平板上的單菌落進(jìn)行劃線分離，直至得到純的單菌落并保存在斜面上備用。

1.3抑菌能力的測定

采用LB固體培養(yǎng)基抑菌圈法進(jìn)行抑菌活性的測定。用接種環(huán)分別挑取純化好的內(nèi)生菌單菌落接入裝有20 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng) 48 h，取出后用無菌水調(diào)至D值一致。將指示病原菌接入PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，無菌過濾后取上清備用。

采用對峙培養(yǎng)法，取200 μL指示病原菌濾液并用無菌玻璃棒均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，干燥后用滅菌打孔器對稱打4個(gè)孔，取35 μL內(nèi)生菌發(fā)酵液滴于孔中，置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)，每處理各3個(gè)重復(fù)。從培養(yǎng)第1天開始觀察菌落生長情況，并記錄內(nèi)生菌形成的透明圈直徑。抑菌能力通過計(jì)算內(nèi)生菌菌落形成的透明圈直徑與孔直徑的比值（D/d值）來評價(jià)：D/d值越大，抑菌能力越強(qiáng)；比值越小，抑菌能力越弱；比值為1時(shí)表示菌落無抑菌能力。

1.4菌株的分子鑒定

將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌能力的菌株進(jìn)行總DNA的提取。采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[5]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rDNA全序列的測定，將所測序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性搜索，以確定菌株的分類地位。

2結(jié)果與分析

2.1小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性

，分離的27株內(nèi)生細(xì)菌對供試病原菌的抑菌能力差別較大，有6株內(nèi)生菌對供試的所有病原菌均未表現(xiàn)出抑菌活性，而多數(shù)菌株對2種以上的病原菌表現(xiàn)出抑制活性。此外，同一菌株對不同病原菌的抑制能力也存在很大差異，如R10對番茄枯萎病菌和番茄炭疽病菌的抑制能力很強(qiáng)，但對蘿卜黑斑病菌卻無抑菌活性；L17、R18對蘿卜黑斑病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，但對番茄炭疽病菌的抑菌活性卻很低。從整體上看，小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，R43、L01、L02、L05、L16、L20、S03等7株內(nèi)生細(xì)菌對所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。

2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果

將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生菌16S rDNA序列與GenBank中的同源序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，這些菌株分別與芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobum）的細(xì)菌具有很高的同源性（表2），且多數(shù)菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力的測定結(jié)果

菌種

編號(hào)透明圈直徑/孔直徑（D/d值）番茄枯

萎病菌番茄炭

疽病菌玉米大

斑病菌小麥赤

霉病菌馬鈴薯干

腐病菌蘿卜黑

斑病菌R051.381.001.002.761.001.28R091.001.002.951.731.001.50R103.864.672.572.812.381.00R121.001.001.001.001.001.00R143.122.241.003.571.002.38R182.151.001.002.242.278.39R411.001.001.001.001.001.00R432.672.052.335.052.675.67R441.001.001.002.111.004.00R461.001.001.001.001.001.00R473.141.003.103.332.093.00R481.001.001.001.712.544.95L012.382.091.714.002.626.15L022.131.672.003.252.237.17L053.574.333.812.332.221.91L101.001.001.001.001.001.00L121.001.001.001.001.001.00L131.731.001.002.832.257.22L152.252.452.001.002.501.00L162.722.362.954.252.22 6.92L171.731.002.113.381.959.43L181.001.001.001.001.001.00L192.273.763.142.382.181.00L202.352.763.336.002.188.33S013.674.572.763.051.821.00S033.194.383.713.482.582.50SD33.144.483.522.482.271.00

內(nèi)生菌的16S rDNA的鑒定結(jié)果

菌株NCBI比對結(jié)果序列相似性

（%）R43，L01，L16Bacillus cereus100Bacillus thuringiensis100Bacillus subtilis100L19，R18Bacillus pumilus100L17Bacillus simplex100R10 Bacillus idriensis100R14，R47Paenibacillus ehimensis99S01Pseudomonas syringae97L02，L05，L20 Ralstonia pickettii100S03Sinorhizobum melioti100

3結(jié)論

植物體可以看作是被許多不同細(xì)菌開發(fā)的不同生境的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，不同的內(nèi)生菌可以占據(jù)不同的生態(tài)位，它們相互作用并在植物體內(nèi)維持著微生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應(yīng)用潛力，是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。本研究運(yùn)用抑菌圈法對小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌拮抗植物病原菌的能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明， 多數(shù)菌株對不同的病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制能力。經(jīng)16S rDNA序列分析表明，多數(shù)具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬的一些種類對外界有害因子的抵抗力強(qiáng)，菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、制霉菌素等多種活性物質(zhì)對植物病原菌有明顯的抑制作用[6]。蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis由于能產(chǎn)生δ內(nèi)毒素，對鱗翅目等昆蟲的幼蟲有毒殺作用而被用以制造生物農(nóng)藥，是常用的生防資源菌[7]。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬的許多菌株不僅可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等，從而有效促進(jìn)植物的生長，而且能抑制多種病原菌的活性，從而顯著提高植物的抗病性。

作為防風(fēng)固沙的先鋒物種，小葉錦雞兒的生態(tài)學(xué)意義遠(yuǎn)大于其經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，發(fā)掘與其共生的微生物資源不僅對探索極端環(huán)境中內(nèi)生細(xì)菌-宿主植物的協(xié)同進(jìn)化研究有著重要的指導(dǎo)意義，而且有助于我們更加透徹地認(rèn)識(shí)其共生體系的形成及抗逆機(jī)理。期待能夠從研究中找到增強(qiáng)小葉錦雞兒抗逆性的合適途徑，進(jìn)而對沙漠化的治理起到積極的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hallmann J，Quadt-Hallmann A，Mahaffee W F，et al. Bacterial endophytes in the agricultural crops[J]. Canadian Journal of Microbiology，1997，43（10）：895-914.

[2]Kiers E T，Denison R F. Sanctions，cooperation，and the stability of plant-rhizosphere mutualisms[J]. Annual Review of Ecology，Evolution，and Systematics，2008，39：215-236.

[3]Ryan R P，Germaine K，F(xiàn)ranks A，et al. Bacterial endophytes：recent developments and applications[J]. FEMS Microbiology Letters，2008，278（1）：1-9.

[4]牛西午. 中國錦雞兒屬植物資源研究——分布及分種描述[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，1999，19（5）：107-133.

[5]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[6]許曼琳，段永平，吳祖建，等. 芽孢桿菌兩菌株對香蕉炭疽病菌的抑制作用及其機(jī)制[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24（4）：522-527.

[7]李怡萍，梁革梅，仵均祥，等. 蘇云金芽孢桿菌殺蟲機(jī)理及害蟲對其抗性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，38（9）：118-128.

2結(jié)果與分析

2.1小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性

，分離的27株內(nèi)生細(xì)菌對供試病原菌的抑菌能力差別較大，有6株內(nèi)生菌對供試的所有病原菌均未表現(xiàn)出抑菌活性，而多數(shù)菌株對2種以上的病原菌表現(xiàn)出抑制活性。此外，同一菌株對不同病原菌的抑制能力也存在很大差異，如R10對番茄枯萎病菌和番茄炭疽病菌的抑制能力很強(qiáng)，但對蘿卜黑斑病菌卻無抑菌活性；L17、R18對蘿卜黑斑病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，但對番茄炭疽病菌的抑菌活性卻很低。從整體上看，小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，R43、L01、L02、L05、L16、L20、S03等7株內(nèi)生細(xì)菌對所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。

2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果

將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生菌16S rDNA序列與GenBank中的同源序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，這些菌株分別與芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobum）的細(xì)菌具有很高的同源性（表2），且多數(shù)菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力的測定結(jié)果

菌種

編號(hào)透明圈直徑/孔直徑（D/d值）番茄枯

萎病菌番茄炭

疽病菌玉米大

斑病菌小麥赤

霉病菌馬鈴薯干

腐病菌蘿卜黑

斑病菌R051.381.001.002.761.001.28R091.001.002.951.731.001.50R103.864.672.572.812.381.00R121.001.001.001.001.001.00R143.122.241.003.571.002.38R182.151.001.002.242.278.39R411.001.001.001.001.001.00R432.672.052.335.052.675.67R441.001.001.002.111.004.00R461.001.001.001.001.001.00R473.141.003.103.332.093.00R481.001.001.001.712.544.95L012.382.091.714.002.626.15L022.131.672.003.252.237.17L053.574.333.812.332.221.91L101.001.001.001.001.001.00L121.001.001.001.001.001.00L131.731.001.002.832.257.22L152.252.452.001.002.501.00L162.722.362.954.252.22 6.92L171.731.002.113.381.959.43L181.001.001.001.001.001.00L192.273.763.142.382.181.00L202.352.763.336.002.188.33S013.674.572.763.051.821.00S033.194.383.713.482.582.50SD33.144.483.522.482.271.00

內(nèi)生菌的16S rDNA的鑒定結(jié)果

菌株NCBI比對結(jié)果序列相似性

（%）R43，L01，L16Bacillus cereus100Bacillus thuringiensis100Bacillus subtilis100L19，R18Bacillus pumilus100L17Bacillus simplex100R10 Bacillus idriensis100R14，R47Paenibacillus ehimensis99S01Pseudomonas syringae97L02，L05，L20 Ralstonia pickettii100S03Sinorhizobum melioti100

3結(jié)論

植物體可以看作是被許多不同細(xì)菌開發(fā)的不同生境的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，不同的內(nèi)生菌可以占據(jù)不同的生態(tài)位，它們相互作用并在植物體內(nèi)維持著微生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應(yīng)用潛力，是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。本研究運(yùn)用抑菌圈法對小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌拮抗植物病原菌的能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明， 多數(shù)菌株對不同的病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制能力。經(jīng)16S rDNA序列分析表明，多數(shù)具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬的一些種類對外界有害因子的抵抗力強(qiáng)，菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、制霉菌素等多種活性物質(zhì)對植物病原菌有明顯的抑制作用[6]。蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis由于能產(chǎn)生δ內(nèi)毒素，對鱗翅目等昆蟲的幼蟲有毒殺作用而被用以制造生物農(nóng)藥，是常用的生防資源菌[7]。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬的許多菌株不僅可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等，從而有效促進(jìn)植物的生長，而且能抑制多種病原菌的活性，從而顯著提高植物的抗病性。

作為防風(fēng)固沙的先鋒物種，小葉錦雞兒的生態(tài)學(xué)意義遠(yuǎn)大于其經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，發(fā)掘與其共生的微生物資源不僅對探索極端環(huán)境中內(nèi)生細(xì)菌-宿主植物的協(xié)同進(jìn)化研究有著重要的指導(dǎo)意義，而且有助于我們更加透徹地認(rèn)識(shí)其共生體系的形成及抗逆機(jī)理。期待能夠從研究中找到增強(qiáng)小葉錦雞兒抗逆性的合適途徑，進(jìn)而對沙漠化的治理起到積極的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hallmann J，Quadt-Hallmann A，Mahaffee W F，et al. Bacterial endophytes in the agricultural crops[J]. Canadian Journal of Microbiology，1997，43（10）：895-914.

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[3]Ryan R P，Germaine K，F(xiàn)ranks A，et al. Bacterial endophytes：recent developments and applications[J]. FEMS Microbiology Letters，2008，278（1）：1-9.

[4]牛西午. 中國錦雞兒屬植物資源研究——分布及分種描述[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，1999，19（5）：107-133.

[5]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[6]許曼琳，段永平，吳祖建，等. 芽孢桿菌兩菌株對香蕉炭疽病菌的抑制作用及其機(jī)制[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24（4）：522-527.

[7]李怡萍，梁革梅，仵均祥，等. 蘇云金芽孢桿菌殺蟲機(jī)理及害蟲對其抗性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，38（9）：118-128.

2結(jié)果與分析

2.1小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性

，分離的27株內(nèi)生細(xì)菌對供試病原菌的抑菌能力差別較大，有6株內(nèi)生菌對供試的所有病原菌均未表現(xiàn)出抑菌活性，而多數(shù)菌株對2種以上的病原菌表現(xiàn)出抑制活性。此外，同一菌株對不同病原菌的抑制能力也存在很大差異，如R10對番茄枯萎病菌和番茄炭疽病菌的抑制能力很強(qiáng)，但對蘿卜黑斑病菌卻無抑菌活性；L17、R18對蘿卜黑斑病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，但對番茄炭疽病菌的抑菌活性卻很低。從整體上看，小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，R43、L01、L02、L05、L16、L20、S03等7株內(nèi)生細(xì)菌對所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。

2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果

將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生菌16S rDNA序列與GenBank中的同源序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，這些菌株分別與芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobum）的細(xì)菌具有很高的同源性（表2），且多數(shù)菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力的測定結(jié)果

菌種

編號(hào)透明圈直徑/孔直徑（D/d值）番茄枯

萎病菌番茄炭

疽病菌玉米大

斑病菌小麥赤

霉病菌馬鈴薯干

腐病菌蘿卜黑

斑病菌R051.381.001.002.761.001.28R091.001.002.951.731.001.50R103.864.672.572.812.381.00R121.001.001.001.001.001.00R143.122.241.003.571.002.38R182.151.001.002.242.278.39R411.001.001.001.001.001.00R432.672.052.335.052.675.67R441.001.001.002.111.004.00R461.001.001.001.001.001.00R473.141.003.103.332.093.00R481.001.001.001.712.544.95L012.382.091.714.002.626.15L022.131.672.003.252.237.17L053.574.333.812.332.221.91L101.001.001.001.001.001.00L121.001.001.001.001.001.00L131.731.001.002.832.257.22L152.252.452.001.002.501.00L162.722.362.954.252.22 6.92L171.731.002.113.381.959.43L181.001.001.001.001.001.00L192.273.763.142.382.181.00L202.352.763.336.002.188.33S013.674.572.763.051.821.00S033.194.383.713.482.582.50SD33.144.483.522.482.271.00

內(nèi)生菌的16S rDNA的鑒定結(jié)果

菌株NCBI比對結(jié)果序列相似性

（%）R43，L01，L16Bacillus cereus100Bacillus thuringiensis100Bacillus subtilis100L19，R18Bacillus pumilus100L17Bacillus simplex100R10 Bacillus idriensis100R14，R47Paenibacillus ehimensis99S01Pseudomonas syringae97L02，L05，L20 Ralstonia pickettii100S03Sinorhizobum melioti100

3結(jié)論

植物體可以看作是被許多不同細(xì)菌開發(fā)的不同生境的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，不同的內(nèi)生菌可以占據(jù)不同的生態(tài)位，它們相互作用并在植物體內(nèi)維持著微生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應(yīng)用潛力，是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。本研究運(yùn)用抑菌圈法對小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌拮抗植物病原菌的能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明， 多數(shù)菌株對不同的病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制能力。經(jīng)16S rDNA序列分析表明，多數(shù)具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬的一些種類對外界有害因子的抵抗力強(qiáng)，菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、制霉菌素等多種活性物質(zhì)對植物病原菌有明顯的抑制作用[6]。蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis由于能產(chǎn)生δ內(nèi)毒素，對鱗翅目等昆蟲的幼蟲有毒殺作用而被用以制造生物農(nóng)藥，是常用的生防資源菌[7]。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬的許多菌株不僅可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等，從而有效促進(jìn)植物的生長，而且能抑制多種病原菌的活性，從而顯著提高植物的抗病性。

作為防風(fēng)固沙的先鋒物種，小葉錦雞兒的生態(tài)學(xué)意義遠(yuǎn)大于其經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，發(fā)掘與其共生的微生物資源不僅對探索極端環(huán)境中內(nèi)生細(xì)菌-宿主植物的協(xié)同進(jìn)化研究有著重要的指導(dǎo)意義，而且有助于我們更加透徹地認(rèn)識(shí)其共生體系的形成及抗逆機(jī)理。期待能夠從研究中找到增強(qiáng)小葉錦雞兒抗逆性的合適途徑，進(jìn)而對沙漠化的治理起到積極的作用。

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