安祖花ISSR—PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和確立

楊京燕+葛亞英+田丹青

摘要：為建立適宜安祖花DNA 的 ISSR-PCR 擴(kuò)增體系，采用單因子試驗(yàn)對影響 ISSR-PCR 反應(yīng)的各組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+ 濃度）進(jìn)行了優(yōu)化，確立了適合安祖花的條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的最佳 ISSR-PCR 反應(yīng)體系，即在 20 μL PCR 反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL；并利用2條引物對15個(gè)安祖花品種進(jìn)行了穩(wěn)定性鑒定，為安祖花的遺傳多樣性分析及育種工作提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：安祖花；ISSR；單因素試驗(yàn)；體系優(yōu)化

中圖分類號： S682.1+40.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0038-03

收稿日期：2014-03-12

基金項(xiàng)目：浙江省杭州市種子種苗專項(xiàng)（編號：20110332H14）；臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院科研課題。

作者簡介：楊京燕（1977—），女，浙江臺(tái)州人，碩士，講師，從事園林規(guī)劃設(shè)計(jì)、園林花卉栽培與育種研究。E-mail：robinyjy@163.com。

通信作者：葛亞英，碩士，助理研究員，主要從事花卉栽培與育種研究。E-mail：gyy954002@126.com。ISSR（inter-simlpe sequence repeat）是一種簡單重復(fù)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，具有操作簡單、實(shí)驗(yàn)成本低、DNA樣品用量少、多態(tài)性高、信息量大、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已在品種鑒定、植物遺傳多樣性、物種的進(jìn)化關(guān)系、系統(tǒng)學(xué)比較與物種分類等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1]，目前已成功用于觀賞鳳梨、菊花、萬壽菊[2-4]等觀賞植物的遺傳多樣性、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。安祖花（Anthurium andraeanum Lind.）又名紅掌、花燭，是天南星科花燭屬多年生草本植物，具有奇特別致的葉形、色彩艷麗的佛焰苞和肉穗狀花序，已成為目前全球發(fā)展最快、需求量大的熱帶切花和盆栽花卉。安祖花品種繁多，深受消費(fèi)者喜愛的花色、株型或者具有較強(qiáng)抗病性、抗逆性的安祖花類型具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是育種的主要目標(biāo)。欲獲得控制這些優(yōu)良性狀的基因，就需要建立適合安祖花的 DNA體外擴(kuò)增體系，繼而構(gòu)建遺傳圖譜，對基因進(jìn)行精確定位，加速育種工作進(jìn)程。本研究通過提取安祖花葉片的基因組總DNA，并對ISSR反應(yīng)體系中主要組分Taq DNA 聚合酶濃度、模板DNA 濃度、引物濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度等進(jìn)行優(yōu)化，確立的ISSR反應(yīng)體系可為進(jìn)一步利用ISSR標(biāo)記技術(shù)開展安祖花種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、連鎖遺傳圖譜構(gòu)建和控制優(yōu)良性狀基因的 QTL 定位等方面奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為安祖花15個(gè)品種。

1.2方法

1.2.1基因組 DNA 提取用 CTAB 法提取基因組DNA[5]，DNA質(zhì)量和濃度用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測，統(tǒng)一稀釋為20 ng/μL，保存于 -20 ℃ 冰箱中備用。

1.2.2ISSR-PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增選用的引物根據(jù)British Columbia 大學(xué)公布的ISSR引物序列，由上海生工有限公司合成；10×Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、100 bp DNA marker 均購自杭州鼎國生物技術(shù)有限公司。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性45 s，52 ℃ 復(fù)性45 s，72 ℃ 延伸 90 s，共42個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 7 min后4 ℃ 保存。PCR 擴(kuò)增在美國ABI Applied Biosystems 2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗(yàn)試驗(yàn)在基本擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL反應(yīng)體系中，10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物2.0 μL、20 ng/μL模板 1.0 μL）的基礎(chǔ)上，以UBC834為引物，對模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs和Mg2+ 5個(gè)影響ISSR-PCR擴(kuò)增的主要因素開展單因子濃度試驗(yàn)，各反應(yīng)參數(shù)作4～6個(gè)水平的梯度優(yōu)化（表1），PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定各成分的最佳濃度，每個(gè)優(yōu)化好了的參數(shù)直接用于下一個(gè)優(yōu)化參數(shù)的反應(yīng)體系中。

表1ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計(jì)

影響因子濃度梯度模板DNA（ng/μL）0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0Taq DNA聚合酶（U）0.50、0.75、1.00、1.25、1.50引物（μmol/L）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0MgCl2（mmol/L）1.0、1.5、2.0、2.5dNTPs（mmol/L）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0

1.2.4ISSR反應(yīng)體系引物篩選及檢測根據(jù)優(yōu)化的ISSR反應(yīng)體系，選用2個(gè)品種對48 條ISSR引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用6% 非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測，確定多態(tài)性較好且條帶清晰的引物，選用其中2條引物對15個(gè)品種進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增檢測。

2結(jié)果與分析

2.1安祖花基因組DNA的提取

將用CTAB 法提取15份安祖花葉片得到的 DNA，通過瓊脂糖跑膠和分光光度計(jì)測定其質(zhì)量和濃度，結(jié)果DNA條帶清晰，雜質(zhì)含量較少，可以滿足ISSR的試驗(yàn)要求。

2.2安祖花ISSR-PCR體系的優(yōu)化

2.2.1DNA模板量對PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)設(shè)置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL，結(jié)果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時(shí)擴(kuò)增出的條帶較模糊，1.0～4.0 ng/μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰，容易判讀。通過多次重復(fù)比較試驗(yàn)，在2.0 ng/μL的模板用量時(shí)最穩(wěn)定，且清晰，可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應(yīng)的要求。

2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對PCR反應(yīng)的影響通過5種不同Taq DNA聚合酶用量比較，20 μL反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶比較弱，且條帶數(shù)少；當(dāng)Taq酶用量為0.75～1.50 U時(shí)，均能擴(kuò)增出明顯條帶。試驗(yàn)中Taq 酶用量為1.0 U時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰，確定Taq酶用量在1.0 U時(shí)最適合該P(yáng)CR體系。

2.2.3引物濃度對PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)中引物濃度的變化對產(chǎn)物的多少和條帶的亮度影響較大，引物終濃度在 0.5～1.0 μmol/L 時(shí)雖然能擴(kuò)增出產(chǎn)物，但是條帶數(shù)少且有些擴(kuò)增條帶較弱；1.5～3.0 μmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)重復(fù)比較，引物濃度為 1.5 μmol/L時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定，條帶清晰且經(jīng)濟(jì)，確定安祖花ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

2.2.4Mg2+濃度對PCR反應(yīng)的影響由可見，當(dāng)Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時(shí)，條帶很弱，幾乎看不清楚；隨濃度增大，擴(kuò)增條帶數(shù)增加，Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最為豐富，且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

2.2.5dNTPs濃度對PCR反應(yīng)的影響當(dāng)dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出條帶；0.6、0.8 mmol/L 時(shí)條帶缺失現(xiàn)象嚴(yán)重，且多數(shù)條帶模糊不清；當(dāng)dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增帶型基本一致，但 0.4 mmol/L 時(shí)條帶最清晰穩(wěn)定，確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性鑒定及確立

根據(jù)各影響因子試驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)體系中各組分最佳濃度進(jìn)行引物篩選，篩選得到的引物隨機(jī)選取2條，對15個(gè)品種進(jìn)行體系穩(wěn)定性鑒定，結(jié)果如圖7，引物U835和U846對每份DNA樣品均能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的DNA片段，說明該ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的，適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

3討論與結(jié)論

有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道[6-9]很多，成分用量變化對ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。本研究采用單因素試驗(yàn)，對影響ISSR-PCR的各個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行單獨(dú)的梯度試驗(yàn)，找出最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明ISSR-PCR 反應(yīng)受反應(yīng)組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度）變化影響，同時(shí)各組分均有一個(gè)相對適宜的用量范圍，濃度過低，不能滿足擴(kuò)增要求；濃度過高，又降低各組分的活性，影響擴(kuò)增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但不同反應(yīng)體系產(chǎn)生的結(jié)果也有可能不同[7]，甚至同一種植物在不同的試驗(yàn)條件下研究結(jié)果都有差異[10]。張紅心等對16個(gè)紅掌種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)采用的是25 μL ISSR反應(yīng)體系，其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR體系中，除PCR Buffer含量與其一致外，其余組分含量均存在差異。

通過篩選得到其中2條引物，對安祖花15個(gè)品種進(jìn)行ISSR擴(kuò)增分析，每個(gè)品種均能擴(kuò)增出清晰條帶，并且多態(tài)性均達(dá)100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，同時(shí)也說明ISSR分子標(biāo)記適合對安祖花進(jìn)行遺傳多樣性分析。

本試驗(yàn)建立的體系是采用單因素梯度試驗(yàn)來進(jìn)行最佳組合的摸索，通過鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶，這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析，為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]周延清，楊清香，張改娜. 生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：166-167.

[2]葛亞英，張飛，沈曉嵐，等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（4）：726-733.

[3]繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波，等. 應(yīng)用ISSR對25個(gè)小菊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（11）：3735-3740.

[4]曾麗，趙梁軍，孫佳，等. 萬壽菊屬品種資源遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（1）：215-222.

[5]葛亞英，沈曉嵐，田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：64-65.

[6]孫葉迎，陳麗飛，劉樹英，等. 長白山區(qū)杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2013（24）：92-95.

[7]呂巖楨，王雷，張興旺，等. 山核桃ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，17（7）：30-31，35.

[8]邱長玉，高國慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[9]劉菲，李萍，何俊榮，等. 國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝，2011（17）：136-139.

[10]柴丹丹，陳書霞，孟煥文，等. 黃瓜SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：274-279.

[11]張紅心，陳超，王桂蘭，等. 紅掌種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國植物生理學(xué)會(huì).中國植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編.2009：332.王楠，薛永來，杜道林. 彗星試驗(yàn)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：41-43.

2.2安祖花ISSR-PCR體系的優(yōu)化

2.2.1DNA模板量對PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)設(shè)置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL，結(jié)果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時(shí)擴(kuò)增出的條帶較模糊，1.0～4.0 ng/μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰，容易判讀。通過多次重復(fù)比較試驗(yàn)，在2.0 ng/μL的模板用量時(shí)最穩(wěn)定，且清晰，可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應(yīng)的要求。

2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對PCR反應(yīng)的影響通過5種不同Taq DNA聚合酶用量比較，20 μL反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶比較弱，且條帶數(shù)少；當(dāng)Taq酶用量為0.75～1.50 U時(shí)，均能擴(kuò)增出明顯條帶。試驗(yàn)中Taq 酶用量為1.0 U時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰，確定Taq酶用量在1.0 U時(shí)最適合該P(yáng)CR體系。

2.2.3引物濃度對PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)中引物濃度的變化對產(chǎn)物的多少和條帶的亮度影響較大，引物終濃度在 0.5～1.0 μmol/L 時(shí)雖然能擴(kuò)增出產(chǎn)物，但是條帶數(shù)少且有些擴(kuò)增條帶較弱；1.5～3.0 μmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)重復(fù)比較，引物濃度為 1.5 μmol/L時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定，條帶清晰且經(jīng)濟(jì)，確定安祖花ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

2.2.4Mg2+濃度對PCR反應(yīng)的影響由可見，當(dāng)Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時(shí)，條帶很弱，幾乎看不清楚；隨濃度增大，擴(kuò)增條帶數(shù)增加，Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最為豐富，且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

2.2.5dNTPs濃度對PCR反應(yīng)的影響當(dāng)dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出條帶；0.6、0.8 mmol/L 時(shí)條帶缺失現(xiàn)象嚴(yán)重，且多數(shù)條帶模糊不清；當(dāng)dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增帶型基本一致，但 0.4 mmol/L 時(shí)條帶最清晰穩(wěn)定，確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性鑒定及確立

根據(jù)各影響因子試驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)體系中各組分最佳濃度進(jìn)行引物篩選，篩選得到的引物隨機(jī)選取2條，對15個(gè)品種進(jìn)行體系穩(wěn)定性鑒定，結(jié)果如圖7，引物U835和U846對每份DNA樣品均能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的DNA片段，說明該ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的，適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

3討論與結(jié)論

有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道[6-9]很多，成分用量變化對ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。本研究采用單因素試驗(yàn)，對影響ISSR-PCR的各個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行單獨(dú)的梯度試驗(yàn)，找出最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明ISSR-PCR 反應(yīng)受反應(yīng)組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度）變化影響，同時(shí)各組分均有一個(gè)相對適宜的用量范圍，濃度過低，不能滿足擴(kuò)增要求；濃度過高，又降低各組分的活性，影響擴(kuò)增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但不同反應(yīng)體系產(chǎn)生的結(jié)果也有可能不同[7]，甚至同一種植物在不同的試驗(yàn)條件下研究結(jié)果都有差異[10]。張紅心等對16個(gè)紅掌種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)采用的是25 μL ISSR反應(yīng)體系，其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR體系中，除PCR Buffer含量與其一致外，其余組分含量均存在差異。

通過篩選得到其中2條引物，對安祖花15個(gè)品種進(jìn)行ISSR擴(kuò)增分析，每個(gè)品種均能擴(kuò)增出清晰條帶，并且多態(tài)性均達(dá)100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，同時(shí)也說明ISSR分子標(biāo)記適合對安祖花進(jìn)行遺傳多樣性分析。

本試驗(yàn)建立的體系是采用單因素梯度試驗(yàn)來進(jìn)行最佳組合的摸索，通過鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶，這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析，為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]周延清，楊清香，張改娜. 生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：166-167.

[2]葛亞英，張飛，沈曉嵐，等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（4）：726-733.

[3]繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波，等. 應(yīng)用ISSR對25個(gè)小菊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（11）：3735-3740.

[4]曾麗，趙梁軍，孫佳，等. 萬壽菊屬品種資源遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（1）：215-222.

[5]葛亞英，沈曉嵐，田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：64-65.

[6]孫葉迎，陳麗飛，劉樹英，等. 長白山區(qū)杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2013（24）：92-95.

[7]呂巖楨，王雷，張興旺，等. 山核桃ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，17（7）：30-31，35.

[8]邱長玉，高國慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[9]劉菲，李萍，何俊榮，等. 國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝，2011（17）：136-139.

[10]柴丹丹，陳書霞，孟煥文，等. 黃瓜SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：274-279.

[11]張紅心，陳超，王桂蘭，等. 紅掌種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國植物生理學(xué)會(huì).中國植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編.2009：332.王楠，薛永來，杜道林. 彗星試驗(yàn)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：41-43.

2.2安祖花ISSR-PCR體系的優(yōu)化

2.2.1DNA模板量對PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)設(shè)置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL，結(jié)果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時(shí)擴(kuò)增出的條帶較模糊，1.0～4.0 ng/μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰，容易判讀。通過多次重復(fù)比較試驗(yàn)，在2.0 ng/μL的模板用量時(shí)最穩(wěn)定，且清晰，可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應(yīng)的要求。

2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對PCR反應(yīng)的影響通過5種不同Taq DNA聚合酶用量比較，20 μL反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶比較弱，且條帶數(shù)少；當(dāng)Taq酶用量為0.75～1.50 U時(shí)，均能擴(kuò)增出明顯條帶。試驗(yàn)中Taq 酶用量為1.0 U時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰，確定Taq酶用量在1.0 U時(shí)最適合該P(yáng)CR體系。

2.2.3引物濃度對PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)中引物濃度的變化對產(chǎn)物的多少和條帶的亮度影響較大，引物終濃度在 0.5～1.0 μmol/L 時(shí)雖然能擴(kuò)增出產(chǎn)物，但是條帶數(shù)少且有些擴(kuò)增條帶較弱；1.5～3.0 μmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)重復(fù)比較，引物濃度為 1.5 μmol/L時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定，條帶清晰且經(jīng)濟(jì)，確定安祖花ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

2.2.4Mg2+濃度對PCR反應(yīng)的影響由可見，當(dāng)Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時(shí)，條帶很弱，幾乎看不清楚；隨濃度增大，擴(kuò)增條帶數(shù)增加，Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最為豐富，且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

2.2.5dNTPs濃度對PCR反應(yīng)的影響當(dāng)dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出條帶；0.6、0.8 mmol/L 時(shí)條帶缺失現(xiàn)象嚴(yán)重，且多數(shù)條帶模糊不清；當(dāng)dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增帶型基本一致，但 0.4 mmol/L 時(shí)條帶最清晰穩(wěn)定，確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性鑒定及確立

根據(jù)各影響因子試驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)體系中各組分最佳濃度進(jìn)行引物篩選，篩選得到的引物隨機(jī)選取2條，對15個(gè)品種進(jìn)行體系穩(wěn)定性鑒定，結(jié)果如圖7，引物U835和U846對每份DNA樣品均能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的DNA片段，說明該ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的，適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

3討論與結(jié)論

有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道[6-9]很多，成分用量變化對ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。本研究采用單因素試驗(yàn)，對影響ISSR-PCR的各個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行單獨(dú)的梯度試驗(yàn)，找出最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明ISSR-PCR 反應(yīng)受反應(yīng)組分（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度）變化影響，同時(shí)各組分均有一個(gè)相對適宜的用量范圍，濃度過低，不能滿足擴(kuò)增要求；濃度過高，又降低各組分的活性，影響擴(kuò)增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但不同反應(yīng)體系產(chǎn)生的結(jié)果也有可能不同[7]，甚至同一種植物在不同的試驗(yàn)條件下研究結(jié)果都有差異[10]。張紅心等對16個(gè)紅掌種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)采用的是25 μL ISSR反應(yīng)體系，其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR體系中，除PCR Buffer含量與其一致外，其余組分含量均存在差異。

通過篩選得到其中2條引物，對安祖花15個(gè)品種進(jìn)行ISSR擴(kuò)增分析，每個(gè)品種均能擴(kuò)增出清晰條帶，并且多態(tài)性均達(dá)100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，同時(shí)也說明ISSR分子標(biāo)記適合對安祖花進(jìn)行遺傳多樣性分析。

本試驗(yàn)建立的體系是采用單因素梯度試驗(yàn)來進(jìn)行最佳組合的摸索，通過鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶，這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析，為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]周延清，楊清香，張改娜. 生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：166-167.

[2]葛亞英，張飛，沈曉嵐，等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（4）：726-733.

[3]繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波，等. 應(yīng)用ISSR對25個(gè)小菊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（11）：3735-3740.

[4]曾麗，趙梁軍，孫佳，等. 萬壽菊屬品種資源遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（1）：215-222.

[5]葛亞英，沈曉嵐，田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：64-65.

[6]孫葉迎，陳麗飛，劉樹英，等. 長白山區(qū)杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2013（24）：92-95.

[7]呂巖楨，王雷，張興旺，等. 山核桃ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，17（7）：30-31，35.

[8]邱長玉，高國慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[9]劉菲，李萍，何俊榮，等. 國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝，2011（17）：136-139.

[10]柴丹丹，陳書霞，孟煥文，等. 黃瓜SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：274-279.

[11]張紅心，陳超，王桂蘭，等. 紅掌種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國植物生理學(xué)會(huì).中國植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編.2009：332.王楠，薛永來，杜道林. 彗星試驗(yàn)檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：41-43.