復(fù)方龍星片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

徐光臨，易 月，劉 力，徐德生

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科，上海 200021）

復(fù)方龍星片處方來源于全國名老中醫(yī)黃吉庚教授的經(jīng)驗方，由地龍、黃芩、制南星、干姜組方，具有清熱化痰、平喘止咳之功效，臨床用于咳嗽、氣喘偏痰熱型者，急慢性支氣管炎、哮喘辨證偏熱型者。復(fù)方龍星片作為醫(yī)院制劑在本院臨床應(yīng)用已近20年，療效確切，具有較強的進一步開發(fā)為新藥的可行性。文獻報道地龍中次黃嘌呤[1－2]的平喘作用與黃芩中黃芩苷[3－4]的抗炎作用與復(fù)方龍星片的功效吻合，確為其中的有效成分。筆者采用薄層色譜（TLC）法對方中地龍、黃芩進行了定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法分別對次黃嘌呤及黃芩苷進行了含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀（四元泵，美國安捷倫科技有限公司）；薄層層析用硅膠（青島海洋化工廠）；（CQX25－06型超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司，500 W，33 kHz）；分析天平（上海天平儀器廠）；DL－8R型冷凍離心機（上海市離心機械研究所）。地龍對照藥材(批號200405)、亮氨酸對照品(批號9701)、纈氨酸對照品(批號9701)、黃芩苷對照品(批號201117)、次黃嘌呤對照品(批號200402)，均購自中國藥品生物制品檢定所；地龍、黃芩飲片（徐重道中藥飲片有限公司）；復(fù)方龍星片(醫(yī)院自制 ，滬 藥 制 字 Z05100130，0.3 g／片 ，批 號 100415，100715，110223，110427，110916，130326）；液相用甲醇、乙腈為色譜純，雙蒸水（醫(yī)院自制），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別(TLC法)

2.1.1 地龍

取復(fù)方龍星片適量，研細，稱取1 g，加水10 mL，加熱至沸，冷卻，離心，取上清液作為供試品溶液。取地龍飲片、中間品和缺地龍的陰性片各1 g，同法制成地龍飲片、中間品和陰性對照品溶液。另取地龍對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取亮氨酸、纈氨酸對照品，加水制成每1 mL各含 1 mg和0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇 －冰醋酸 －水（4∶1 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品、中間品及飲片溶液色譜中，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，缺地龍的陰性對照品溶液對鑒別無干擾。結(jié)果見圖1。

2.1.2 黃芩

取復(fù)方龍星片適量，研細，稱取1 g，加甲醇 10 mL，超聲 1 h，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另取中間品、缺黃芩的陰性片各1 g，黃芩飲片0.5 g，同法制成中間品、陰性對照品、黃芩飲片溶液。再取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照 TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗，吸取供試品、中間品、黃芩飲片和陰性對照品溶液各6 μL以及黃芩苷對照品溶液2 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯－丁酮 －甲酸－水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試中間品及黃芩飲片溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點，缺黃芩的陰性對照品溶液對鑒別無干擾。結(jié)果見圖 2。

圖1 地龍薄層色譜圖

圖2 黃芩薄層色譜圖

2.2 次黃嘌呤含量測定(HPLC法)

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：迪馬 Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：水 － 甲醇 － 乙腈（98.8 ∶0.6 ∶0.6）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：25℃；檢測波長：248 nm。按上述色譜條件，分別吸取次黃嘌呤對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL檢測。結(jié)果見圖3。可見，供試品溶液色譜中次黃嘌呤達到基線分離，陰性對照品溶液中無相應(yīng)色譜峰。

表1 次黃嘌呤加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

2.2.4 樣品含量測定

分別取不同批號的復(fù)方龍星片，依法測定。結(jié)果見表2。

圖3 次黃嘌呤高效液相色譜圖

表2 樣品含量測定結(jié)果(標(biāo)示量的%)

2.2.2 溶液制備

取次黃嘌呤對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.206 mg的高質(zhì)量濃度對照品溶液；精密量取高質(zhì)量濃度對照品溶液2 mL，置 5 mL容量瓶中，50%甲醇定容，制成每 1 mL含0.082 3 mg的中質(zhì)量濃度對照品溶液；精密量取高質(zhì)量濃度對照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，50%甲醇定容，制成每1 mL含0.020 6 mg的低質(zhì)量濃度對照品溶液。將復(fù)方龍星片研細，取約0.25 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入 50%甲醇50 mL，超聲 30 min，于 4 000 r／min 轉(zhuǎn)速，離心 20 min，上清液減壓濃縮并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，50%甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。按生產(chǎn)工藝制備方法制備缺地龍的陰性對照品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對照品溶液低質(zhì)量濃度1，10 μL，中質(zhì)量濃度 2，10 μL，高質(zhì)量濃度 5，10 μL 注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo) Y、進樣量 X（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y＝4 595.5 X＋13.859，r＝0.999 95（n ＝6）。結(jié)果表明，次黃嘌呤進樣量在 0.020 6 ～2.06 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗：取次黃嘌呤對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL。結(jié)果峰面積積分值的 RSD為1.3%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取次黃嘌呤對照品溶液及供試品溶液，于12 d內(nèi)分多次進樣，每次進樣10 μL，測定峰面積。結(jié)果的 RSD分別為0.079%和1.35%，表明溶液在12 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號130326）樣品6份，依法制備供試品溶液，測定含量。結(jié)果次黃嘌呤平均含量為0.066%，RSD為1.50%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號130326）約0.125 g，精密稱定，共9份，分別加入約1.2倍、1倍、0.8倍樣品含量的次黃嘌呤對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行3份，按供試品溶液制備方法制備溶液，進樣10 μL，測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.3 黃芩苷(HPLC法)含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：迪馬 Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水 － 磷酸（47 ∶53 ∶0.2）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm。按上述色譜條件，分別吸取黃芩苷對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL進樣檢測。結(jié)果見圖4?？梢?，供試品溶液色譜中黃芩苷達到基線分離，陰性對照品溶液中無相應(yīng)色譜峰。

2.3.2 溶液制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含0.130 8 mg的高質(zhì)量濃度對照品溶液；精密量取高質(zhì)量濃度對照品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，70%乙醇定容，制成每1 mL含0.065 4 mg的中質(zhì)量濃度對照品溶液；精密量取高質(zhì)量濃度對照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，70%乙醇定容，制成每1 mL含0.013 08 mg的低質(zhì)量濃度對照品溶液。將復(fù)方龍星片研細，取約0.25 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，水浴加熱，回流30 min，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，70%乙醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按生產(chǎn)工藝制備方法制備缺黃芩的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對照品溶液低質(zhì)量濃度5 μL，中質(zhì)量濃度 5，10，15 μL，高質(zhì)量濃度 10，15 μL 注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo) Y、進樣量 X（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y＝3 408.5 X＋15.979，r＝1.000 0（n＝6）。結(jié)果表明，黃芩苷進樣量在 0.065 4～1.962 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗：取黃芩苷對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次進樣5 μL。結(jié)果峰面積積分值 RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取黃芩苷對照品溶液、供試品溶液，于24 h內(nèi)分多次進樣，測定黃芩苷峰面積。結(jié)果 RSD分別為0.99%和0.60%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號130326）樣品6份，依法制備供試品溶液，測定黃芩苷含量。結(jié)果平均含量為4.55%，RSD為1.09%(n ＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為130326）約0.1 g，精密稱定，共9份，分別加入約1.2倍、1倍、0.8倍樣品含量的黃芩苷對照品，每個質(zhì)量濃度平行3份，按供試品溶液制備方法制備溶液，進樣5 μL，測定含量，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

2.3.4 樣品含量測定

分別取不同批號的復(fù)方龍星片，依法測定。結(jié)果見表2。

3 討論

流動相選擇：次黃嘌呤含量測定中曾參考水－甲醇－四氫呋喃[5]系統(tǒng)，考慮四氫呋喃的毒性，為盡量避免使用，同時簡化流動相配制操作，用液相常用試劑乙腈替代，改為水－甲醇－乙腈系統(tǒng)，通過對水－甲醇－乙腈比例的考察，流動相確定為水－甲醇－乙腈（98.8 ∶0.6 ∶0.6）。

樣品提取方法和時間選擇：次黃嘌呤含量測定時，樣品處理方法溶劑考察了50%甲醇和雙蒸水，結(jié)果次黃嘌呤提取率雙蒸水比50%甲醇略高，因地龍中含有較多蛋白質(zhì)，并色譜柱使用壽命角度考慮，選擇50%甲醇為提取溶劑；超聲0.5 h與加熱回流0.5 h的提取率相同，且超聲提取0.5 h，1 h次黃嘌呤提取率差異不明顯，故確定為超聲提取0.5 h。黃芩苷含量測定中，樣品處理方法溶劑考察了甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇，結(jié)果70%乙醇中復(fù)方龍星片黃芩苷含量最高；提取方法考察了加熱回流和超聲提取，結(jié)果加熱回流法中黃芩苷的提取率較高；提取時間考察了回流 0.5，1，1.5 h，結(jié)果黃芩苷的提取率并無明顯差別，回流時間選擇 0.5 h。

本試驗中所建立的定性及定量方法，簡單、快捷、準(zhǔn)確，能有效控制復(fù)方龍星片的質(zhì)量。

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