利用質(zhì)譜技術(shù)解析糖類結(jié)構(gòu)的研究進展

賈秀娟，劉有軍，楊 煥，周義發(fā)

(1. 東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024；2. 空軍航空大學飛行基礎(chǔ)訓(xùn)練基地，吉林 長春 130022；3. 東北師范大學圖書館，吉林 長春 130024)

糖的研究已有100多年的歷史，過去人們一直認為糖類物質(zhì)在生物體內(nèi)只是一種能量物質(zhì)或結(jié)構(gòu)物質(zhì)，隨著對糖類研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)糖具有多種重要的生理活性，一切重要的生命活動過程(包括胚胎發(fā)育、細胞癌變、病毒感染以及植物生長調(diào)節(jié)等)都有糖鏈的參與[1]。糖的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，要了解糖的功能首先要對其結(jié)構(gòu)進行分析。

糖類化合物以多種形式存在于自然界中，主要包括單糖及其衍生物、寡糖、多糖、復(fù)合多糖和糖苷類。復(fù)合多糖包括糖蛋白和糖脂兩大類。與其他生物大分子一樣，糖鏈的一級結(jié)構(gòu)是二級以上高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。但與蛋白質(zhì)、核酸相比，糖鏈的一級結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。要測定糖鏈的一級結(jié)構(gòu)，需要解決以下幾方面的問題：1)糖鏈的分子質(zhì)量；2)糖鏈的糖基組成，各種組成單糖的比例；3)每一個單糖殘基的D-或L-構(gòu)型，吡喃環(huán)或呋喃環(huán)形式；4)各個單糖殘基之間的連接次序；5)每個糖苷鍵所取的α-或β-異頭異構(gòu)形式；6)每個糖殘基上羥基被取代的情況，有2個以上羥基被同時取代，則意味著這個糖殘基處在叉狀鏈的分支點上；7)糖鏈和非糖部分(肽鏈、脂類物質(zhì)等)連接點的情況[2]。

顯然，要弄清楚上述所有問題，不是一種技術(shù)或方法就可以做到的。到目前為止，已建立的糖結(jié)構(gòu)解析方法有：化學方法(甲基化分析、部分酸水解、smith降解、過碘酸氧化、乙酰解、甲醇解等)和生物學方法(酶解、免疫學方法等)。近年來，物理學方法(核磁共振、紅外光譜、激光拉曼光譜及色譜等)也用于糖類物質(zhì)的分析。糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，涉及到立體異構(gòu)體(一個單糖若含有4個不對稱碳，則有24個立體異構(gòu)體)，單糖之間的連接位置(1-1、1-2、1-3、1-4、1-6連接)和每個糖苷鍵的α、β構(gòu)型[3]。此外，糖鏈還具有微觀不均一性。因此，傳統(tǒng)的分析技術(shù)在糖鏈結(jié)構(gòu)分析中遇到了瓶頸。直到20世紀50年代末，質(zhì)譜技術(shù)開始用于糖的分析，促進了糖類研究的快速發(fā)展。質(zhì)譜以其靈敏度高、信息直觀等特點，已成為糖鏈研究中重要的、不可缺少的手段。特別是80年代末，各種軟電離技術(shù)的相繼誕生，使高極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的糖及其復(fù)合物的直接分析成為可能[4-8]。本工作將綜述各種質(zhì)譜技術(shù)在糖類物質(zhì)分析中的應(yīng)用進展。

1 電子轟擊質(zhì)譜(electron impact mass spectrometry, EI-MS)

質(zhì)譜法研究糖的結(jié)構(gòu)已有50多年的歷史。EI-MS是最早用于糖類分析的質(zhì)譜技術(shù)，樣品經(jīng)氣化后，以分子狀態(tài)在離子源中與具有一定能量的電子碰撞，從而使樣品分子電離，隨后具有過剩能量的分子、離子碎裂成各種碎片離子。這些離子在一定的電場作用下，通過分析器把具有不同質(zhì)荷比的離子分開，最后到達接收器。它具有較好的重復(fù)性、較高的靈敏度和較多的碎片峰。EI-MS可以得到低聚糖衍生物典型的裂解規(guī)律，并可以推斷所含的基團以及該化合物的結(jié)構(gòu)[9]；EI-MS還可以研究糖基的連接方式，不同的連接方式使得某些離子的相對強度發(fā)生變化，據(jù)此來區(qū)分連接位置的異構(gòu)體。Finan等[10]首次應(yīng)用電子轟擊質(zhì)譜研究了幾種單糖和二糖。然而，由于糖的難揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性，限制了EI-MS對低聚糖的研究。因此，人們采用衍生化的方法將糖進行甲基化或乙?；?，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓳]發(fā)的糖衍生物，這對于聚合度較低的糖可以增強揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。Moor等[11]較詳細地研究了25種低聚糖甲醚，并闡述了質(zhì)譜在其結(jié)構(gòu)分析上的用途和意義。但是，對于聚合度較高的低聚糖，它們的衍生物揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性仍然很低，所以不能用EI-MS法研究。目前，EI-MS 分析多糖主要用于甲基化后的氣質(zhì)聯(lián)機，以測定多糖連接方式[12-14]。

2 化學電離質(zhì)譜(chemical ionization mass spectrometry, CI-MS)

化學電離質(zhì)譜是Munson和Field于1966年提出的[15-16]。CI-MS的電離過程是通過反應(yīng)氣產(chǎn)生的反應(yīng)離子與樣品分子之間的離子-分子反應(yīng)實現(xiàn)的。常用的反應(yīng)氣有甲烷、異丁烷、氨、水、氫等，它們在離子源中的主要離子分別是CH5+、C2H5+、C4H9+、NH4+、(NH3)2H+、(NH3)3H+、H3O+、(H2O)2H+、(H2O)3H+、H3+等。EI-MS雖然可以得到較多的與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，但是往往得不到分子離子；而CI-MS由于所傳遞的能量較少，所以更容易得到較強的分子離子(準分子離子)。在糖類物質(zhì)的研究中，常以NH3作為反應(yīng)氣，因為它可以提供更為專一的軟電離條件，使得糖類可以更有效的電離。以NH3為反應(yīng)氣體，利用CI-MS可以得到[M+NH4]+作為基峰，從而很容易推導(dǎo)出化合物的相對分子質(zhì)量。Lomax等[17]以NH3為反應(yīng)氣，觀察到聚合度為15的多糖。由于CI-MS得到的碎片信息很少，人們經(jīng)常把2種電離方式相結(jié)合以得到更為豐富的質(zhì)譜信息。例如，陸德培等[18]利用EI-MS和CI-MS研究了全乙?；途勰咎琴|(zhì)譜，得到了木二糖到木六糖全乙?；锏牧呀鈾C理和特征碎片離子。CI-MS除了可以較好的測定糖的相對分子質(zhì)量外，還可獲得糖的連接方式信息。Reznicek等[19]以氨氣為反應(yīng)氣，通過調(diào)節(jié)氣體的壓力等參數(shù)確定了狗娃花皂甙2中糖部分的連接方式和連接點情況。但CI-MS仍然不適合聚合度高的多糖結(jié)構(gòu)分析。

3 快原子轟擊質(zhì)譜(fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)

快原子轟擊質(zhì)譜是20世紀80年代初期發(fā)展起來的一種軟電離技術(shù)[20]，它的出現(xiàn)使在CI-MS和EI-MS中遇到的樣品氣化問題迎刃而解。FAB-MS的原理是使用快速中性原子，通常用Ar轟擊樣品表面，使之直接在基質(zhì)溶液中電離。因為快原子束呈電中性，所以能有效地轟擊樣品使之發(fā)生電離，一般都能得到較強的[M+H]+峰(正離子模式)和[M-H]-峰(負離子模式)作為譜圖的主要信號，以及一定反應(yīng)連接順序的特征碎片離子峰，使極性高、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的糖及糖綴合物的直接分析成為可能。FAB-MS的典型靈敏度為1 nmol樣品/μL基質(zhì)，它不僅可以測定寡糖及其衍生物的分子質(zhì)量，而且可以測定聚合度高于30的糖的分子質(zhì)量[21]。除了測定分子質(zhì)量外，F(xiàn)AB-MS還可確定糖鏈中糖殘基的連接位點和序列，此方法已廣泛用于多糖的分析。Egge等[22-23]對人奶中的寡糖結(jié)構(gòu)進行研究，在測定分子質(zhì)量的同時，還根據(jù)糖的分子質(zhì)量計算糖殘基(如去氧己糖、己糖、己糖胺等)的組成和數(shù)量，另外，通過FAB-MS的序列離子分析，推測出八糖的2種異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。 Angel等[24]通過過碘酸對糖的專一性剪切、重氫硼化物還原、甲基化，再利用FAB-MS分析，測定了糖的連接位點。

雖然寡糖在不進行衍生化的情況下可以直接用FAB-MS分析，但是靈敏度較低。為了提高儀器的靈敏度，需在分析條件上進行優(yōu)化，比如選擇更好的轟擊粒子、合適的底物或加入某些添加劑等。但更有效的方法是在糖的還原端進行修飾，為質(zhì)譜分析提供一個荷電中心。例如，連接堿性、疏水性基團或使化合物成鹽來提高FAB-MS的分析靈敏度，從而簡化對譜圖中碎片峰的解析，得到更好的序列離子信息。Anderegg等[25]在麥芽糖的還原端衍生一季胺鹽基團，使質(zhì)譜測定靈敏度提高了約100倍。此外，對糖的羥基進行全甲基化、全乙酰化和全三甲基硅烷化等衍生化，也能顯著提高FAB-MS的靈敏度，而且圖譜中清晰可辨分子離子和碎片離子，所以，該方法通常被用于天然界中存在的寡糖的序列測定。例如，Gr?nberg等[26]對人奶中直鏈或支鏈寡糖序列的分析測定。全甲基化衍生物由于甲基的引入而使底物相對較小的質(zhì)量數(shù)得到增加，同時大大提高了熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性，故被用于糖復(fù)合物的質(zhì)譜分析，它既適合CI-MS和EI-MS測定，也適合FAB-MS測定。

4 電噴霧質(zhì)譜(electro-spray ionization mass spectrometry, ESI-MS)

電噴霧電離是一種軟電離技術(shù)，起源于1917年，但到80年代才被應(yīng)用于質(zhì)譜中。1985年，美國耶魯大學化工系教授約翰·芬恩(John B. Fenn)首次報道了ESI-MS研究成果，并因發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法而榮獲2002年諾貝爾化學獎。目前的電噴霧接口可以安裝在四極桿質(zhì)譜、磁質(zhì)譜和飛行時間質(zhì)譜上。電噴霧電離過程是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量的帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。通過這種軟電離方式，ESl-MS 既可以分析大分子也可分析小分子。對于分子質(zhì)量在1 000 u 以下的小分子, 會產(chǎn)生[M+H]+或[M-H]-離子, 選擇相應(yīng)的正離子或負離子形式進行檢測, 就可得到相應(yīng)的分子質(zhì)量。而高達20 000 u 的大分子在ESI-MS 中生成一系列多電荷離子, 通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)能夠得到樣品的分子質(zhì)量, 準確度高于0.01%。據(jù)報道，ESI-MS通過多電荷離子已能測出分子質(zhì)量達2×105的糖蛋白[27-28]。

與FAB-MS相比，ESI-MS還有一個顯著的優(yōu)點，即可以分析含有羧基或硫酸根等官能團的較大寡糖鏈。Anastyuk等[31]利用串聯(lián)ESI質(zhì)譜和MALDI-TOF質(zhì)譜對褐藻膠糖進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明褐藻膠糖中含有非硫酸化的低聚糖和單硫酸化的巖藻寡糖混合物，并且確定了硫酸化位點。

5 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜 (matrix-assisted laser desorption mass spectrometry, MALDI-MS)

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜于20世紀80年代末問世，是由德國物理學家Hillenkamp和生物物理學家Karas共同發(fā)明的[32]。它是將被分析物的溶液和某種基質(zhì)(多為有機小分子)溶液按適當比例混合，蒸發(fā)溶劑，使被分析物與基質(zhì)共結(jié)晶，再用一定波長的脈沖式激光進行照射，從而實現(xiàn)樣品的離子化，產(chǎn)生的離子在飛行管中飛行的時間不同，從而得到分離。基質(zhì)分子必須能有效吸收激光能量，使基質(zhì)分子和樣品解吸到氣相并得到電離。這種離子化方式電離出的離子常用飛行時間(TOF)檢測器檢測，所以MALDI與TOF連在一起稱為基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。它也是一種軟電離技術(shù)，該技術(shù)產(chǎn)生的分子離子穩(wěn)定，不易裂解。理論上講，只要飛行管的長度足夠長，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，所以被成功地用于蛋白質(zhì)、糖脂、多糖[33]及寡糖[34]等生物分子的分析。蛋白質(zhì)和糖蛋白除通常給出強的[M+H]+離子外，還給出較弱的雙電荷或多電荷離子，中性寡糖分子給出的是單一的[M+Na]+離子峰。因此，MALDI-TOF-MS可準確、快速、靈敏的測定大分子多糖的分子質(zhì)量。Stahl等[35]采用3-氨基喹啉作為基質(zhì)，利用MALDI-TOF-MS分析菊粉中的果聚糖，檢測的果聚糖的最大相對分子質(zhì)量可達10 ku。目前，這項技術(shù)可直接測定聚合度達40的多糖[36]。

在MALDI-MS測定中，基質(zhì)的性質(zhì)及樣品的制備方法對獲得理想的質(zhì)譜圖非常關(guān)鍵。基質(zhì)的作用是稀釋樣品，吸收激發(fā)光能量及解離樣品?；|(zhì)與樣品的晶體形態(tài)、樣品與基質(zhì)比率對譜圖質(zhì)量都有影響，因此，對于不同的糖類需選擇不同的基質(zhì)才能獲得更好的效果[37]。此外，MALDI受樣品中所含添加劑、緩沖鹽的影響較小，其靈敏度也是各類電離方式中最高的。

與ESI-MS相比，MALDI-TOF-MS具有快速、樣品需求量少(fmol～pmol級)、靈敏度高等優(yōu)點。比較典型的實驗是用1 pmol樣品，5 min內(nèi)就可以獲得寡糖的分子質(zhì)量，其準確度最多相差0.5個質(zhì)量數(shù)[38]。對糖而言，MALDI-TOF-MS過去主要用于分子質(zhì)量的測定。1994年，Kaufmann發(fā)現(xiàn)源后衰變過程(post-source decay, PSD)能被折光儀檢測[39]，因此，借助PSD方式下的折光TOF儀，MALDI-TOF-MS不再僅局限于分子質(zhì)量的測定，在subpmol量范圍內(nèi)也能提供詳細的寡糖及糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息[40]。Hilz等[41]分析了板栗中木糖葡聚糖的分支情況。Jacobs等[42]分析了水溶性半纖維素的乙?；〈闆r。為了進一步加強對生物大分子結(jié)構(gòu)的解析能力，人們又發(fā)展了MALDI的碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)技術(shù)。與MALDI-PSD相比，CID更穩(wěn)定。CID技術(shù)是指在離子源的后面增加一個碰撞腔，對離子進行碰撞碎裂，可獲得更細微的結(jié)構(gòu)信息。Spina等[43]用氦氣作為碰撞氣體，DHB為基質(zhì)，用CID將離子再次打碎后進行分析，對Lacto-N-Fu-copentaode I(LNFP I)的序列進行測定，通過糖還原末端碎片辨認出一系列離子，從而得到糖的序列信息。由于MALDI-TOF-MS具有其他方法不可取代的優(yōu)勢，相信會成為適用范圍更廣的測定糖復(fù)合物分子質(zhì)量及其結(jié)構(gòu)的方法。

6 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在糖分析中的應(yīng)用

色譜是一種很好的分離手段，可以將復(fù)雜混合物中的各個組分分離開，但是它在糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析方面表現(xiàn)較差。而質(zhì)譜可以在一次分析中提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，能進行有效的定性和定量分析。因此，將兩者結(jié)合是進行糖復(fù)合物高效分析的重要方法。

氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)是一種以氣相色譜系統(tǒng)作為質(zhì)譜進樣系統(tǒng)的分離檢測技術(shù)，已成為一項標準化氣相色譜技術(shù)被廣泛使用。在應(yīng)用GC/MS進行多糖結(jié)構(gòu)分析時，通常先將其降解為結(jié)構(gòu)簡單的單糖或寡糖，再衍生成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的衍生物，通過對降解糖衍生物的定性、定量分析，可以得到多糖的基本結(jié)構(gòu)。例如：先將多糖中的自由羥基完全甲基化，然后完全酸水解，將醛基還原，再進行乙?；玫綋]發(fā)性乙?；苌?，然后進行GC/MS分析。這項技術(shù)在糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析中得到普遍應(yīng)用，如Liu等[44]對海膽黃多糖(SEP)進行結(jié)構(gòu)分析，認為SEP是以1→4糖苷鍵連接為主鏈的葡聚糖，并且每9個殘基的C6位上有1個1→6糖苷鍵連接的葡萄糖支鏈。徐年軍等[45]利用GC/MS分析了海洋灘涂生物大米草中的多糖。胡坪等[46]對大黃多糖RP-1，RP-2，RP-3的結(jié)構(gòu)進行研究。結(jié)果表明：RP-1 由葡萄糖殘基構(gòu)成，主要連接方式為1，4-連接，并在O-6 位出現(xiàn)支鏈；RP-2 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸組成，主要含有1，4-葡萄糖殘基，同時還有1，2-鼠李糖、1，4，6-甘露糖、葡萄糖等殘基；RP-3 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸組成，主要糖單元為1，5-連接的五碳糖。目前已經(jīng)建立了關(guān)于GC/MS分析多糖結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用最為廣泛的有NIST庫和WILEY庫。

許多不穩(wěn)定或不容易揮發(fā)的物質(zhì)不能利用GC分離，可以用液相色譜(LC)代替GC與質(zhì)譜聯(lián)用。與GC/MS相比，LC/MS省去了甲基化、乙酰化等繁瑣的樣品前處理過程。HPLC/MS能對更復(fù)雜的糖鏈進行分析，例如，梁達清等[47]采用HPLC-ESI-IT-MS方法測定了巴戟天中低聚糖的總含量和各種低聚糖的含量，通過質(zhì)譜圖解析，確定了巴戟天中4種低聚糖的結(jié)構(gòu)，并在巴戟天中發(fā)現(xiàn)了相對分子質(zhì)量為342 u 的二聚體和相對分子質(zhì)量為504 u的三聚糖；趙瑜等[48]利用HPLC-MS/MS對煙草中的7種糖類物質(zhì)進行了定量分析，檢測方法在2～200 mg/L范圍內(nèi)線性良好(r>0.999)，檢出限均在50.0 mg/L以內(nèi)。目前，LC/MS分析糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫不及GC/MS完善，數(shù)據(jù)分析上有一定的困難，需要不斷地探索和補充。

7 結(jié)論

在糖鏈分析中，質(zhì)譜既可以獲得糖鏈樣品的相對分子質(zhì)量的指紋圖譜，又可以與氣相色譜、液相色譜聯(lián)用進行糖鏈樣品的定性定量分析。質(zhì)譜既可以得到糖鏈樣品的單糖組成及含量，也可以用來測定糖鏈的序列和分析糖鏈的連接方式。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，糖鏈的釋放和衍生化方法的不斷改進，以及譜圖解析工作的進一步深入，質(zhì)譜技術(shù)必將成為糖分析的有力工具。

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