GC-QqQ-MS/MS法檢測(cè)油脂類(lèi)功能食品中輻照標(biāo)志物2-十二烷基環(huán)丁酮和2-十四烷基環(huán)丁酮

劉 茜，韓 麗，伊雄海，時(shí)逸吟，張 浩，王國(guó)明，彭 濤，楊振宇，任 碩

(1. 上海杉達(dá)學(xué)院，上海 201209；2. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；3. 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶 400020；4. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

含油脂食品經(jīng)輻照，食品中的游離脂肪酸和三?；视涂尚纬?-烷基環(huán)丁酮(2-alkylcyclobutanones, 2-ACBs)，2-ACBs有著與母體脂肪酸相同的碳原子數(shù)，且烷基位于2號(hào)環(huán)位上。脂肪酸或三酰基甘油的羰基氧失去一個(gè)電子形成環(huán)狀化合物，再經(jīng)重排形成特定脂肪酸的2-ACBs[1-3]，簡(jiǎn)化機(jī)理示于圖1。2-十二烷基環(huán)丁酮(2-dodecylcyclobutanone，2-DCB)是棕櫚酸(C16∶0)的輻解產(chǎn)物，2-十四烷基環(huán)丁酮(2-tetradecylcyclobutanone，2-TCB)是硬脂酸(C18∶0)的輻解產(chǎn)物，它們都是2-ACBs的一員[4]。至今，尚未在未經(jīng)輻照的食品中發(fā)現(xiàn)2-ACBs，因此可將其作為鑒定輻照油脂類(lèi)食品的標(biāo)志物。

目前有豬肉[5]、雞肉、魚(yú)肉[6-7]、花生、餅干[8]和牛肉[9]等含脂食品中2-ACBs檢測(cè)方法的報(bào)道，所使用的檢測(cè)技術(shù)有GC/MS法[10-11]和HPLC-ESI-MS/MS法[12]。但未見(jiàn)輻照油脂類(lèi)功能食品，如魚(yú)油、南瓜籽油、大蒜油軟膠囊等的報(bào)道。

由于軟膠囊類(lèi)基質(zhì)復(fù)雜，2-ACBs是脂溶性化合物，很難與基質(zhì)分離，而串聯(lián)質(zhì)譜具有高選擇性與高靈敏度，能夠?qū)?fù)雜基質(zhì)中的痕量物質(zhì)進(jìn)行確證分析[13-14]。因此，本研究擬通過(guò)優(yōu)化固相萃取(SPE)條件，采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-QqQ-MS/MS)同時(shí)測(cè)定油脂類(lèi)功能食品中輻照標(biāo)志物2-DCB和2-TCB，旨為該類(lèi)食品的檢測(cè)工作提供理論依據(jù)。

圖1 2-烷基環(huán)丁酮形成的簡(jiǎn)化機(jī)理Fig.1 The simplified mechanism of 2-alkylcyclobutanones

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料、試劑

7890A-7000型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；ProElut Silica硅膠固相萃取柱(2 g/12 mL)，12孔固相萃取裝置：上海Dikma公司產(chǎn)品；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；XS603S型電子天平：美國(guó)Mettler Toledo公司產(chǎn)品。

魚(yú)油、南瓜籽油、亞麻籽油和大蒜油軟膠囊：均為未經(jīng)輻照的空白樣品；2-DCB、2-TCB標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98 %)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；正己烷(色譜純)：美國(guó)J.T.Baker 公司產(chǎn)品；叔丁基甲醚(色譜純)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg 2-DCB和2-TCB標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，分別得到1.0 g/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2輻照處理 通過(guò)60Co輻照源進(jìn)行輻照(中國(guó)科學(xué)院上海輻照中心)，劑量率為0.5 kGy/h，空白魚(yú)油、南瓜籽油、亞麻籽油和大蒜油軟膠囊樣品的輻照劑量分別為0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 kGy。

1.2.3樣品處理 稱(chēng)取0.30 g樣品(精確至0.001 g)于具塞離心管中，加入2 mL 正己烷，充分渦旋混合，待凈化。依次用10 mL叔丁基甲醚，10 mL正己烷緩慢潤(rùn)濕固相萃取柱，活化填料；將待凈化液轉(zhuǎn)移至萃取柱，棄去流出液；用10 mL正己烷淋洗；20 mLV(叔丁基甲醚)∶V(正己烷)=1∶99的溶液洗脫，250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶接收。整個(gè)過(guò)程的流速控制在1 mL/min，直至洗脫液完全自然滴出。在35 ℃下，減壓蒸餾至約2 mL后，自然揮干，用正己烷定容至1 mL，待GC-QqQ-MS/MS分析。

1.2.4色譜條件 色譜柱：DB-5MS(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.995%)；恒流，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫：起始溫度80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至150 ℃，再以8 ℃/min升至200 ℃，然后以20 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。

1.2.5質(zhì)譜條件 電子轟擊離子化(EI)，離子源溫度200 ℃，電離能量70 eV，傳輸線(xiàn)溫度280 ℃，溶劑延遲時(shí)間5.0 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

對(duì)于油脂類(lèi)樣品，采用固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化是必不可少的步驟。本實(shí)驗(yàn)采用了ProElut Silica柱、硅膠柱[15-16]、中性氧化鋁柱[12]、Florisil柱[17-18]、PSA柱等固相萃取柱以及GPC方法進(jìn)行樣品的凈化。由于2-ACBs的分子質(zhì)量較小，利用GPC方法的保留時(shí)間短，有大量雜質(zhì)干擾，無(wú)法進(jìn)行定性定量分析，因此沒(méi)有選用GPC方法。對(duì)于油脂類(lèi)功能性食品，ProElut Silica柱相對(duì)于其他填料的固相萃取柱來(lái)說(shuō)，2-DCB和2-TCB的回收率較高，能更好的排除雜質(zhì)干擾，達(dá)到良好的凈化效果，可以滿(mǎn)足分析檢測(cè)的要求，樣品檢測(cè)的色譜圖示于圖2。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先用1.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描分析，獲得2-DCB和2-TCB的一級(jí)質(zhì)譜圖。對(duì)一級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，比較各碎片離子的相對(duì)豐度，選擇豐度較高的2～3個(gè)離子作為母離子。每個(gè)化合物選擇1個(gè)母離子，設(shè)定不同的碰撞能量，對(duì)其產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行掃描，得到子離子掃描質(zhì)譜圖，選擇響應(yīng)最好的2～3個(gè)碎片離子作為子離子。對(duì)不同的母離子、子離子以及碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果列于表1。

圖2 未輻照魚(yú)油樣品(a)，0.03 mg/L 2-DCB和2-TCB標(biāo)準(zhǔn)品(b)，未輻照加標(biāo)魚(yú)油樣品(0.1 mg/kg魚(yú)油，c)，輻照未加標(biāo)魚(yú)油樣品(2 kGy，d)的GC-QqQ-MS/MS色譜圖Fig.2 GC-QqQ-MS/MS chromatograms of non-irradiated fish oil (a), 2-DCB and 2-TCB at 0.03 mg/L (b), non-irradiated fish oil spiked at 0.1 mg/kg (c) and non-spiked fish oil irradiated at 2 kGy (d)

化合物 保留時(shí)間/min 母離子(m/z) 子離子(m/z) 碰撞能量/eV2-DCB12.19883*,703,32-TCB13.911297*,843,3

注：*為定量離子

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 分別取適量1.0 g/L 2-DCB和2-TCB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷配制成濃度為0.005、0.02、0.1、0.5、1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按優(yōu)化的GC-QqQ-MS/MS條件，取1 μL進(jìn)樣，以響應(yīng)值(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程分別為y=60.613 6x-171.295 5和y=19.779 5x-78.831 8，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 8和0.999 9。

2.3.2回收率、精密度和檢測(cè)限 未輻照樣品中不含有2-ACBs，對(duì)4種油脂類(lèi)功能食品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品添加量分別為0.01、0.05、0.10 mg/kg，每一添加水平的樣品數(shù)為6個(gè)，樣品處理和測(cè)定按1.2.3～1.2.5進(jìn)行。分別測(cè)定添加樣品中2-ACBs的含量，計(jì)算添加回收率，加標(biāo)樣品的回收率及精密度列于表2。由表2可見(jiàn)，平均添加回收率為85.6%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7.0%(n=6)。按照10倍信噪比(S/N)確立的方法，定量限(LOQ)為5 μg/kg。

表2 2-DCB和2-TCB的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 輻照劑量對(duì)輻照油脂類(lèi)功能性食品中2-ACBs含量的影響

該研究中油脂類(lèi)功能性食品的輻照劑量分別為0.5、1.0、2.0、5.0、8.0和10.0 kGy，輻照標(biāo)志物2-DCB和2-TCB濃度與輻照劑量的關(guān)系示于圖3。從圖3可見(jiàn)，在0.5～10.0 kGy輻照劑量范圍內(nèi)，輻照劑量與輻照油脂類(lèi)功能性食品中2-DCB和2-TCB濃度呈線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系，這與文獻(xiàn)[19-20]的結(jié)果一致。2-DCB的回歸方程分別為ya=54.161x+20.123(R2=0.999 4)；yb=41.214x+7.137(R2=0.995 6)；yc=46.094x-9.915(R2=0.999 9)；yd=48.658x+28.806(R2=0.996 4)；2-TCB的回歸方程分別為ya=20.907x+6.996(R2=0.999 2)；yb=19.285x+2.823(R2=0.995 7)；yc=17.099x+6.814(R2=0.996 6)；yd=18.267x+7.989(R2=0.996 2)。

理論上，該方法不僅能夠?qū)?jīng)過(guò)輻照的油脂類(lèi)功能食品進(jìn)行定性鑒別，也可以準(zhǔn)確定量，并根據(jù)2-ACBs含量判斷其經(jīng)輻照的劑量。事實(shí)上，樣品貯藏時(shí)間、溫度等環(huán)境條件會(huì)對(duì)其產(chǎn)生的2-ACBs有不同程度的降解，雖然不同劑量與2-ACBs含量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，但無(wú)法準(zhǔn)確、有效的定量。因此，該方法的研究意義在于對(duì)油脂類(lèi)功能食品是否經(jīng)過(guò)輻照給予定性鑒定。

圖3 輻照劑量對(duì)輻照油脂類(lèi)功能性食品中2-DCB和2-TCB含量的影響Fig.3 The influence of irradiation dose to 2-DCB and 2-TCB of irradiated fat-containing function foods

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了ProElut Silica固相萃取柱凈化、GC-QqQ-MS/MS同時(shí)測(cè)定輻照油脂類(lèi)功能食品中2-DCB和2-TCB的方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了前處理?xiàng)l件和儀器條件，并對(duì)4種軟膠囊樣品進(jìn)行檢測(cè)。該方法可有效地排除軟膠囊樣品基質(zhì)的干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定，能為輻照油脂類(lèi)功能食品中輻照標(biāo)志物的檢測(cè)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] WHO Statement on 2-Dodecylcyclobutanone and Re-lated Compounds. 2003.

[2] CREWS C， DRIEFIELD M， THOMAS C. Analysis of 2-alkylcyclobutanones for detection of food irradiation: Current status, needs and prospects[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2012,26(1/2):1-11.

[3] CHEN S， TSUTSUMI T， TAKATSUKI S， et al.Identification of 2-alkylcyclobutanones in nutmeg(Myristicafragrans)[J]. Food chemistry,2012,134(1):359-365.

[4] 張海偉，哈益明，王 鋒. 含脂食品輻解產(chǎn)物2-烷基環(huán)丁酮的研究進(jìn)展[J].輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，2007，25(1)：1-4.

ZHANG Haiwei，HA Yiming，WANG Feng. Progresses in studies on 2-alkylcyclobutanones in irradiated lipid-containing foods[J]. J Radiat Res Radiat Process, 2007，25(1)：1-4(in Chinese).

[5] 鄭建飛，徐 剛，吳明紅，等. 輻照豬肉產(chǎn)生的2-十二烷基環(huán)丁酮?jiǎng)┝繖z測(cè)及其微波加熱影響[J]. 核技術(shù)，2009,32(5)：356-360.

ZHENG Jianfei，XU Gang，WU Minghong，et al. Detection of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated pork and the microwave cooking effects[J]. Nuclear Techniques, 2009,32(5)：356-360(in Chinese).

[6] 韓 麗，王 敏，王傳現(xiàn)，等. 加速溶劑萃取/GC-MS法對(duì)輻照肉類(lèi)食品中2-十二烷基環(huán)丁酮的檢測(cè)[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009,28(1)：76-79.

HAN Li，WANG Min，WANG Chuanxian，et al. Determination of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated foods by accelerated solvent extractor coupled with GC-MS[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2009,28(1)：76-79(in Chinese).

[7] OBANA H， FURUTA M， TANAKA Y. Analysis of 2-alkylcyclobutanones with accelerated solvent extraction to detect irradiated meat and fish[J]. J Agric Food Chem， 2005,53(17):6 603-6 608.

[8] 程 靜，盧業(yè)舉，趙成仕，等. 輻照含脂食品中2-十二烷基環(huán)丁酮?dú)庀嗌V-質(zhì)譜測(cè)定方法研究[J]. 食品科學(xué)，2008,29(12)：627-631.

CHENG Jing，LU Yeju，ZHAO Chengshi，et al. Study on determination of 2-dodecyclcobutanoes with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in irradiated foods containing fat[J]. Food Science, 2008,29(12)：627-631(in Chinese).

[9] 張海偉，王 鋒，周洪杰，等. 吸收劑量、貯藏時(shí)間及貯藏溫度對(duì)輻照牛肉中2-十二烷基環(huán)丁酮的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008,22(6)：816-819.

ZHANG Haiwei，WANG Feng，ZHOU Hongjie，et al. Effects of absorbed dose, storage time and temperature on 2-dodecylcyclobutanone in irradiated beef[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2008,22(6)：816-819(in Chinese).

[10] BSEN 1785:2003. Foodstuffs-detection of irradiated food containing fat-gas chromatographic/mass spectrometric analysis of 2-alkylcyclobutanones[S]. 2003.

[11] GB/T 21926—2008 輻照含脂食品中2-十二烷基環(huán)丁酮測(cè)定 氣相色譜/質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[12] 蔣俊樹(shù)，朱 峰，聶 磊. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定輻照含脂食品中2-十二烷基環(huán)丁酮的研究[J]. 安徽化工，2012,38(3)：67-71.

JIANG Junshu，ZHU Feng，NIE Lei. Determination of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated foods containing fat by HPLC/MS/MS[J]. Anhui Chemical Industry, 2012,38(3)：67-71(in Chinese).

[13] 謝振偉，楊 坪，廖 翀，等. 串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(GC-QqQ-MS/MS)測(cè)定土壤中的有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯[J].中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2008，24(5)：20-24.

XIE Zhenwei，YANG Ping，LIAO Chong，et al. Determination of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls in soil by gas chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry[J]. Environmental Monitoring in China, 2008，24(5)：20-24(in Chinese).

[14] 衛(wèi)碧文，于文佳，鄭 翊，等. 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析玩具材料中木材防腐劑[J]. 環(huán)境化學(xué)，2011，30(6)：1 210-1 213.

WEI Biwen，YU Wenjia，ZHENG Yi，et al. Analysis of preservatives in wooden products by GC/MS[J]. Enviromental Chemistry, 2011，30(6)：1 210-1 213(in Chinese).

[15] 趙月亮，王 鋒，周洪杰，等. 直接溶劑萃取/氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)輻照牛肉中的2-十二烷基環(huán)丁酮[J]. 分析化學(xué)，2012,40(12)：1 919-1 923.

ZHAO Yueliang，WANG Feng，ZHOU Hongjie，et al. Determination of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated beef by direct solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012,40(12)：1 919-1 923(in Chinese).

[16] 張海偉，哈益明，王 鋒，等. 輻解產(chǎn)物2-十二烷基環(huán)丁酮的測(cè)定方法[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,42(3)：989-995.

ZHANG Haiwei，HA Yiming，WANG Feng，et al. Determination of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated products[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2009,42(3)：989-995(in Chinese).

[17] 趙成仕. 輻照肉制品中2-十二烷基環(huán)丁酮的測(cè)定[J]. 化學(xué)分析計(jì)量，2010,19(4)：29-31.

ZHAO Chengshi. Determination of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated meat products[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2010,19(4)：29-31(in Chinese).

[18] 夏 春. 輻照含脂食品中2-十二烷基環(huán)丁酮測(cè)定方法研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011，(9)：15-18.

XIA Chun. Determination of 2-dodecyleyclobutanone in irradiated fat-containing food[J]. Anhui Agriculture, 2011，(9)：15-18(in Chinese).

[19] SIN D W， WONG Y， YAO M W. Application of pentafluorophenyl hydrazine on detecting 2-dodecylcyclobutanone and 2-tetradecylcyclobutanone in irradiated chicken, pork and mangoes by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Eur Food Res Technol, 2006,222(5/6):674-680.

[20] 高玉生, 李曉玉, 陸 地, 等. QuEChERS/GC-MS方法檢測(cè)含脂輻照食品中2-十二烷基環(huán)丁酮與2-十四烷基環(huán)丁酮[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31(增刊)：78-82.

GAO Yusheng，LI Xiaoyu，LU Di，et al. Determination of 2-dodecylcyclobutanone and 2-tetradecylcyclobutanone in irradiated food containing fat by QuEChERS with GC-MS[J]. Journal of Instrumental Analysis， 2012， 31(suppl)：78-82(in Chinese).