大孔樹脂分離沙棘葉總黃酮工藝的研究

楊宏志，王瑞峰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

沙棘又名黑刺、黃酸刺，是胡頹子科沙棘屬的灌木亞喬木[1]。沙棘是藥食兩用植物，其中富含大量的營養(yǎng)物質(zhì)及生物活性物質(zhì)，主要有多糖類、黃酮類、有機(jī)酸、氨基酸及微量元素等[2]。沙棘中的黃酮物質(zhì)主要集中在沙棘葉中，其具有抗衰老、清除體內(nèi)自由基、增強(qiáng)免疫、抗疲勞等生理功能[3]。近年來，關(guān)于沙棘葉總黃酮的利用和研究收到廣泛的關(guān)注，其應(yīng)用范圍也越來越廣，如保健品、飲料、藥品等[4]。

大孔樹脂又稱全多孔樹脂，具有空間立體多空的結(jié)構(gòu)，吸附能力較強(qiáng)，能夠吸附許多芳香族物質(zhì)，還具有選擇性強(qiáng)、操作簡單、再生方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被應(yīng)用植物中生物活性成分的分離純化，如生物堿、內(nèi)酯、總黃酮等化合物[5]。目前有關(guān)大孔樹脂分離沙棘葉總黃酮的研究較少，本實(shí)驗(yàn)主要研究D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-87七種大孔樹脂對(duì)沙棘葉總黃酮的吸附與解析特性，選出最佳樹脂，以期為沙棘葉總黃酮開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，為沙棘葉總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

沙棘葉總黃酮粗提液，來自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，蘆丁標(biāo)品，純度為98.5%，成都邦成生物工程公司，乙醇、亞硝酸鈉、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-8 等樹脂均購自南開大學(xué)化工廠。

1.2 試驗(yàn)儀器

T6 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司、HL-2B 數(shù)顯恒流泵購自上海市精科儀器公司；SG2 型pH 計(jì)，日本島津；BS-100A 數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器，北京中勝儀器設(shè)備有限公司；色譜柱Ф1.6×20 cm，色譜柱Ф2.0×30 cm 均來自北京飛美斯公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

剛出廠的樹脂中含有防腐劑、分散劑等雜質(zhì)，故因此在使用前必須要經(jīng)過除雜處理。將樹脂在水中浸泡24 h，使其充分溶脹[6]。之后將其置于無水乙醇中浸泡24 h，用蒸餾水沖洗至無乙醇味；采用濕法進(jìn)行樹脂裝柱，之后用無水乙醇將樹脂所含的雜質(zhì)沖洗干凈，再用去離子水將剩余的乙醇沖洗干凈；使用5%鹽酸清洗樹脂柱，使其以2 BV·h-1流速流過樹脂；再使用5%的氫氧化鈉清洗樹脂柱，流速為2 BV·h-1，并將清洗好的樹脂置于真空干燥箱中，進(jìn)行干燥處理（約40 ℃），之后置于干燥器中備用[7]。

2.2 樣品液的預(yù)處理

將使用適當(dāng)濃度的乙醇對(duì)沙棘葉中總黃酮進(jìn)行提取，制成澄清的上清液，可以避免雜質(zhì)染堵塞樹脂，不但能夠提高純化率，還可以延長樹脂的使用時(shí)間。樣品液中所含沙棘葉總黃酮的濃度為10.51 mg·mL-1。

2.3 總黃酮含量的測定方法

準(zhǔn)確稱取2.000 1 g 在105 ℃條件下干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，添加甲醇并置于水浴鍋中加熱，使其溶解，待溫度降到室溫后，加入甲醇定容至100 mL。分別準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mL置于10 mL 的容量瓶中，再分別加入1 mL 濃度為5%的三氯化鋁甲醇溶液，6 mL 蒸餾水并加入甲醇定容至10 mL。之后在430 nm 波長下對(duì)其進(jìn)行吸光度測定[8]。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度C 為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖1 所示：

用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

此方程的相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of aloes

此式中：C－樣品濃度（mg·mL-1）；

A－吸光度值；

R－回歸系數(shù)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中總黃酮的濃度C，然后可以計(jì)算出沙棘葉中總黃酮提取的得率。公式如下：

2.4 大孔樹脂的初步篩選

試驗(yàn)選取7 種適合分離沙棘葉總黃酮的大孔吸附樹脂，從中選出最優(yōu)樹脂用于分離總黃酮。

2.4.1 樹脂的靜態(tài)吸附量測定

準(zhǔn)確稱取7 種經(jīng)預(yù)處理的干樹脂D101、X-5、NKA-9、AB-8、D4020、D3520 和XAD-7HP 各10 mL，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入100 mL 濃度為C1的沙棘葉中總黃酮的樣品液，在30 ℃下，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，頻率設(shè)定為130 n·min-1，過濾，可以得到濾中黃酮的濃度（C2）[9]。

樹脂的靜態(tài)吸附率計(jì)算公式如下：

式1 中：A吸附——吸附率，%；

C1——總黃酮初始濃度，mg·mL-1；

C2——總黃酮剩余濃度，mg·mL-1。

按下式計(jì)算靜態(tài)飽和吸附量：

式2 中：M——吸附量，mg·g-1；

C1——總黃酮初始濃度，mg·mL-1；

C2——總黃酮剩余濃度，mg·mL-1；

V——樹脂體積，mL；

M——樹脂質(zhì)量，g。

2.4.2 靜態(tài)解析率的測定

將吸附達(dá)到飽和狀態(tài)的樹脂過濾，用蒸餾水清洗樹脂，除去殘留的溶液，精確加入70%的乙醇溶液100 mL，震蕩處理24 h，然后將解吸液過濾出來，測定其中的總黃酮含量，以此來計(jì)算其解吸率[10]。

解吸率計(jì)算公式如下：

公式3 中：B——解吸率，%

Cn——洗脫液濃度，mg·mL-1；

Vn——洗脫液的體積，mL；

M——靜態(tài)飽和吸附量，mg·g-1；

m——樹脂質(zhì)量，g。

2.5 洗脫條件及靜態(tài)吸附條件的確定

2.5.1 吸附溫度對(duì)沙棘葉總黃酮吸附量的影響

取15 mL 經(jīng)預(yù)處理的樹脂，裝入到250 mL 三角瓶，加入100 mL 含有沙棘葉總黃酮的溶液，震蕩處理10 h，進(jìn)行吸附，溫度設(shè)定為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55 ℃。計(jì)算總黃酮的濃度，從而算出吸附率和吸附液濃度，以此得出最優(yōu)吸附溫度[11]。

2.5.2 吸附時(shí)間對(duì)沙棘葉總黃酮吸附量的影響

取15 mL 經(jīng)預(yù)處理的樹脂，裝入到250 mL 三角瓶，加入100 mL 含有沙棘葉總黃酮的溶液，在45 ℃下震蕩10 h，進(jìn)行吸附。每隔1h 收集上清液，計(jì)算總黃酮的濃度，從而算出吸附率和吸附液濃度，以此得出最優(yōu)吸附時(shí)間。

2.5.3 洗脫溫度對(duì)沙棘葉總黃酮解吸率的影響

量取15 mL 吸附總黃酮達(dá)到飽和狀態(tài)的樹脂7份，用去離子水對(duì)其進(jìn)行清洗，置于7 支250 mL 的三角瓶中，分別加入100 mL 75%的乙醇，將溫度調(diào)節(jié)為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55 ℃，振蕩洗脫10 h。收集上清液，檢測其中總黃酮含量，計(jì)算出解吸率，由解吸率得出最適洗脫溫度。

2.5.4 洗脫時(shí)間對(duì)沙棘葉中總黃酮解吸率的影響

量取15 mL 吸附總黃酮達(dá)到飽和狀態(tài)的樹脂，用去離子水對(duì)其進(jìn)行清洗，置于250 mL 的三角瓶中，加入100 mL 75%的乙醇，溫度為25 ℃，震蕩洗脫10 h，每1 h 吸取上清液，檢測其中總黃酮含量，計(jì)算出解吸率，由解吸率得出最適洗脫時(shí)間。

2.5.5 乙醇濃度對(duì)沙棘葉中總黃酮解吸率的影響

量取15 mL 吸附總黃酮達(dá)到飽和狀態(tài)的樹脂，用去離子水對(duì)其進(jìn)行清洗，置于250 mL 的三角瓶中，分別加入100 mL 濃度為25%、35%、45%、55%、65%、75%乙醇100 mL，震蕩洗脫10 h。檢測其中總黃酮含量，計(jì)算出解吸率，由解吸率得出最適乙醇濃度。

2.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

2.6.1 上樣速率對(duì)總黃酮吸附效果的影響

將已制好的150 mL 樹脂濕法裝入色譜柱（40 cm×2.0 cm）中，將總黃酮粗提液作為上樣液，并且控制粗提液流出液的速度，分別為1.0、2.01、3.0、4.0、5.0、6.0 mL·min-1，收集流出液，采用HPLC 法檢測，當(dāng)洗脫液濃度與上樣液濃度相同時(shí)，停止上樣，計(jì)算其中所含總黃酮的量，通過總黃酮的量及流出液的體積計(jì)算出每毫升樹脂所能夠吸附總黃酮的量，從而確定最佳速率。

2.6.2 上樣液濃度對(duì)總黃酮吸附效果的影響

采用濕法進(jìn)行樹脂裝柱，取已制好的150 mL 樹脂裝入色譜柱（40 cm×2.0 cm）中，將總黃酮粗提液作為上樣液，濃度為0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg·mL-1，吸附速率保持不變，收集流出液，采用HPLC 法檢測，當(dāng)洗脫液濃度與上樣液濃度相同時(shí)，停止上樣，計(jì)算其中所含總黃酮的量，通過總黃酮的量及流出液的體積計(jì)算出每毫升樹脂所能夠吸附總黃酮的量，從而確定最佳濃度。

2.6.3 洗脫液乙醇濃度對(duì)總黃酮吸附效果的影響

采運(yùn)用濕法將樹脂裝入色譜柱，在最優(yōu)吸附條件進(jìn)行初級(jí)樹脂吸附，使樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)。再對(duì)流出液進(jìn)行清洗，使其在波長450 nm 的條件下沒有吸收峰，然后用5%、25%、45%、65%、85%的乙醇洗脫，速率為3 BV·h-1，乙醇的體積為4 BV。對(duì)流出液進(jìn)行高效液相色譜檢測，得出解吸率，確定乙醇的最優(yōu)濃度。

2.6.4 解吸速率對(duì)樹脂作用效果的影響

對(duì)樹脂進(jìn)行飽和吸附處理，再對(duì)流出液進(jìn)行清洗，使其在波長450 nm 的條件下沒有吸收峰，分別取洗脫速率1、2、3 、4 和5 BV·h-165%的乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫處理，洗脫液的體積為4 BV。對(duì)流出液進(jìn)行高效液相色譜檢測，得出解吸率，確定最佳解吸速率。

2.6.5 洗脫劑用量對(duì)總黃酮吸附效果的影響

對(duì)樹脂進(jìn)行飽和吸附處理，再對(duì)流出液進(jìn)行清洗，使其在波長450 nm 的條件下沒有吸收峰，再用65%的乙醇溶液對(duì)其進(jìn)行洗脫，速率為3 BV·h-1，洗脫液體積為1、2、3、4 和5 BV。計(jì)算出對(duì)應(yīng)的解吸率，確定洗脫劑的最佳用量。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 樹脂的初篩

靜態(tài)試驗(yàn)得出7 種樹脂的解吸及吸附結(jié)果，如表1 所示：

表1 大孔樹脂靜態(tài)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of the static experiment

由表1 可知，樹脂X-5 的吸附量、吸附率及解吸率都是七種樹脂中最高的，故具有較好的吸附能力。而樹脂AB-5 和D3520 的吸附能力稍差，但優(yōu)于其他四種樹脂。選取樹脂X-5、AB-5 和D3520 來進(jìn)行靜態(tài)吸附及解吸的試驗(yàn)，由此確定最優(yōu)樹脂材料。

3.2 樹脂洗脫條件及靜態(tài)吸附條件的選擇

3.2.1 吸附溫度的確定

吸附溫度與吸附率的影響關(guān)系如圖2 所示。由圖可以知，當(dāng)吸附溫度在15～25 ℃范圍內(nèi)，吸附率隨溫度的增加而增大，當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃之后，吸附率開始下降，之后隨著溫度的升高而不斷減小，這是由于較高的溫度會(huì)使黃酮性質(zhì)不穩(wěn)定，從而影響吸附效果。在25 ℃時(shí)，三種樹脂的吸附率達(dá)到最大，其中樹脂X-5 的吸附率最大，吸附效果最好，此時(shí)為最適吸附溫度。

圖2 吸附溫度與吸附率的關(guān)系圖Fig.2 The relationship between adsorption temperature and adsorption rate

3.2.2 吸附時(shí)間的確定

吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響如圖3 所示，由圖可知吸附時(shí)間與三種樹脂的吸附率成正比，時(shí)間增加吸附率增大，但當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到3 h 后，吸附率出現(xiàn)小幅下降。吸附時(shí)間為3 h 時(shí)，三種樹脂的吸附率都達(dá)到最大值，其中X-5 的吸附率最高，故吸附時(shí)間3 h為吸附的最適時(shí)間。

圖3 吸附時(shí)間與吸附率的關(guān)系圖Fig.3 The relationship between adsorption time and adsorption rate

3.2.3 洗脫溫度的確定

圖4 為洗脫溫度和洗脫效果的關(guān)系圖。圖4 中，當(dāng)洗脫溫度在15～25 ℃之間時(shí)，洗脫率隨洗脫溫度的升高而增大，在25 ℃時(shí)分別達(dá)到最大值，其中樹脂AB-8 增幅最大，但此時(shí)樹脂X-5 洗脫率最大。當(dāng)溫度超過25 ℃后，洗脫率隨洗脫溫度的升高而不斷減小。故25 ℃為最適洗脫溫度。

圖4 洗脫溫度對(duì)洗脫率影響Fig.4 The effects of temperature on the rate of elution

3.2.4 洗脫時(shí)間的確定

圖5 是洗脫時(shí)間和洗脫率的關(guān)系圖。圖中三種樹脂的洗脫率都隨洗脫時(shí)間的增加而增大，當(dāng)洗脫時(shí)間為2.5 h 時(shí)，樹脂的洗脫率達(dá)到最大值，之后便不再增加，趨于平穩(wěn)。當(dāng)洗脫時(shí)間為2.5 h 時(shí)，X-5 的洗脫率最高，為最優(yōu)樹脂，2.5 h 為最適洗脫時(shí)間。

3.2.5 乙醇濃度的確定

圖6 是乙醇濃度與解析率的關(guān)系圖。由圖可知，隨著乙醇濃度的不斷增加，三種樹脂的解析率也隨之增大，當(dāng)乙醇濃度為65 ℃時(shí)解析率達(dá)到最大值，其中樹脂X-5 的解析率最大。

圖5 洗脫時(shí)間對(duì)洗脫率的影響Fig.5 The effects of the elution time to the elution rate

圖6 乙醇濃度與解吸率的關(guān)系圖Fig.6 The relationship between concentration of ethanol and desorption rate

由上述試驗(yàn)可確定，樹脂X-5 為沙棘葉總黃酮分離的最佳樹脂，具有較高的吸附量、吸附率及解吸率。最優(yōu)靜態(tài)吸附的條件為：吸附溫度25 ℃，吸附時(shí)間3 h；最優(yōu)靜態(tài)解析條件為乙醇濃度65%，解析溫度為25 ℃，解析時(shí)間2.5 h。

3.3 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 上樣速率的確定

表2 為上樣速率與總黃酮吸附量的影響。表中所示，樹脂X-5 的吸附量隨上樣速率的增加而不斷減小，最大值為8.39 mg·mL-1，最小值為4.51 mg·mL-1。工業(yè)生產(chǎn)上既要考慮生產(chǎn)速率，也要考慮生產(chǎn)效率，由此選擇上樣速率2 BV·h-1為最優(yōu)上樣液的流速。

表2 上樣液流速與樹脂吸附總黃酮量的關(guān)系Table 2 The relationship between sample flow velocity and adsorption capacity

3.3.2 上樣液濃度的確定

表3 為上樣液濃度與樹脂吸附量的關(guān)系。由表3 可知，樹脂的吸附量隨著上樣液濃度的增加而不斷增大，當(dāng)上樣液濃度為3 mg·mL-1時(shí)，吸附量達(dá)到最大值，之后吸附量開始不斷降低，上樣濃度過低，樹脂沒有對(duì)黃酮吸附完全，而上樣濃度過高會(huì)使樹脂堵塞，影響吸附效果。故選取上樣液的濃度為3 mg·mL-1。

表3 上樣液濃度與樹脂吸附總黃酮量的關(guān)系Table 3 The relationship between sample concentration and adsorption capacity

3.3.3 乙醇濃度的確定

表4 為乙醇的濃度與解吸率的關(guān)系。解吸率隨著乙醇濃度的增加而不斷升高，當(dāng)濃度為85%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值，為88.1%，但當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，解吸率為87.3%與最高時(shí)的解吸率相差不大，但乙醇的濃度降低很多，工業(yè)生產(chǎn)時(shí)要同時(shí)考慮效率及成本，故選用75%的乙醇進(jìn)行洗脫操作。

表4 乙醇濃度與樹脂解吸率的關(guān)系Table 4 The relationship between ethanol concentration and desorption rate

3.3.4 解吸速率的選擇

解吸速率與解吸率的關(guān)系見表5。當(dāng)解吸速率為1.0 BV·h-1時(shí)，解吸率為86.3%，隨著解吸速率的增大，解吸率逐漸降低，當(dāng)解吸速率為5.0 BV·h-1時(shí)達(dá)到最低值72.9%。故當(dāng)解吸速率為1.0 BV·h-1時(shí)，解吸率為最大值86.3%，但此時(shí)解吸速率較低，導(dǎo)致試驗(yàn)時(shí)間延長，效率下降，故3.0 BV·h-1為最佳解吸速率。

表5 解吸速率與樹脂解吸率的關(guān)系Table 5 The relationship between desorption rate and desorption rate

3.3.5 洗脫劑用量的選擇

表6 為洗脫劑乙醇的用量與解吸率的關(guān)系。由表可知，隨著洗脫體積的增加，解吸率也不斷增大，成正比例關(guān)系。洗脫劑用量為1.0 BV 時(shí)，解吸率為42.8%，當(dāng)洗脫劑用量為4.0 BV 時(shí)，解吸率增大到86.3%，之后解吸率增長幅度不大，過多的洗脫劑會(huì)影響后續(xù)工藝。因此，考慮到生產(chǎn)成本及洗脫效果，洗脫劑的用量選取4.0 BV。

表6 洗脫劑的用量與樹脂解吸率的關(guān)系Table 6 The relationship between the amount of eluent and resin desorption rate

由上述試驗(yàn)可得出，樹脂X-5 對(duì)沙棘葉中總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附最優(yōu)條件及其解吸的最適條件。

4 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-8 七種樹脂的吸附率及解吸率研究，得出X-5 樹脂分離沙棘葉總黃酮的效果最好。確定樹脂在25℃條件下吸附2h 時(shí)的靜態(tài)吸附效果最好；當(dāng)樹脂在25 ℃，洗脫液乙醇的濃度為65%的條件下樹脂的靜態(tài)解吸效果最好。試驗(yàn)得出：在上樣液濃度為3.0 mg·mL-1，吸附速率為3 BV·h-1的條件下，樹脂的動(dòng)態(tài)吸附效果最佳；洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%，體積用量為4.0 BV，解吸速率為3 BV·h-1的條件下，獲得沙棘葉總黃酮的純度為89.72%，總黃酮含量由10.51 mg·mL-1增大到16.73 mg·mL-1，分離的效果較好。研究結(jié)果為利用大孔樹脂分離沙棘葉總黃酮的應(yīng)用提供了理論支持。

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