高產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的篩選及培養(yǎng)條件的確定

甄妮，鹿保鑫

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319）

由于CLA 一般作為天然成分存在于食物之中，因此，國外對共軛亞油酸的研究起步較早。按照時間順序，共軛雙鍵的脂肪酸存在于反芻動物食品中這一結論被國外學者Booth[1]等人在1935年證實，這也是人類研究CLA 所取得的最早、最有價值的結論。到了90年代中期，隨著試驗證實CLA 具有抗擊腫瘤的特性，引發(fā)了各國科研人員極大的研究興趣。我國對CLA 研究及應用起步較晚，2002年作為我國“十五”期間重大科技項目之一奶牛現(xiàn)代集約飼養(yǎng)關鍵技術研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)項目，CLA 被應用于二者當中[2]。隨著人們飲食觀念的不斷提高，具有減肥塑身效用的CLA 功能食品得到了更多消費者的認可，從而帶動了食品研究者和開發(fā)商的研究熱情和生產(chǎn)需求[3]。從目前全球形勢來看，生產(chǎn)CLA 功能性產(chǎn)品的市場在歐洲等發(fā)達國家已經(jīng)接近飽和，市場份額已占85%以上[4]，超過了全球平均水平；而亞洲市場因日本是唯一一個起步較早的國家，該國家生產(chǎn)的CLA 功能性產(chǎn)品已經(jīng)占據(jù)了全亞洲近75%的份額[5]，可再開發(fā)市場潛力較小。這給我國提供了一個千載難逢的發(fā)展機遇，預測我國在內的其他一些亞洲國家才是未來提高CLA 市場份額的新戰(zhàn)場。因此，研究采用七種乳酸菌，分別對其產(chǎn)CLA 的能力進行比較，從中選出產(chǎn)量最高的菌株，并對CLA 的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以共軛亞油酸最佳培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、生長pH 為單因素，進行響應面優(yōu)化分析，確定了菌種生長的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

實驗所使用的菌株來自于微生物菌種保藏管理中心，德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 2、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心嗜酸乳桿菌21 004、干酪乳桿菌20 266、植物乳桿菌20 022、乳酸乳球菌20 411、嗜熱鏈球菌20 373、發(fā)酵乳桿菌22 537。

主要試劑：MRS 培養(yǎng)基。

1.2 主要儀器

LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器；AR2140 電子天平；DRP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱；微量移液器

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將保存于冰箱的7 種乳酸菌接種于脫脂乳中，接種量為2%，混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，作為一代，吸取脫脂乳培養(yǎng)基中的菌液少許，轉接入MRS 培養(yǎng)液體基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，活化兩代后，接種于MRS 斜面中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 發(fā)酵方法

LA 乳化液的配制方法是將Tween-80 和LA分別取用1 mL，同時在冰浴條件下加入蒸餾水88.4 mL，進行超聲波乳化，進行破碎，然后用無菌微孔濾膜0.22 μm 進行過濾除菌，最終獲得CLA 溶液，其濃度為10 mg·mL-1。活化被保存好的菌株，菌種從MRS 固體斜面培養(yǎng)中挑取，并將其接種于37 ℃的MRS 液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)24 h，再活化一次。培養(yǎng)液為兩代活化以后的作為種子液，按照2%的接種量接種到裝有10 mL 的MRS 培養(yǎng)基中，并放入乳化液，靜止培育24 h 后，使底物濃度達到0.4 mg·mL-1。

1.3.3 CLA 標準曲線的制作

CLA 標準品準確稱取2.5 mg，溶劑為正己烷，將其定容在25 mL 容量瓶內，待溶解后吸取0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4.0.45，0.5 mL 放入容量為10 mL 的容量瓶內，將正己烷定容至10 mL 后以獲得CLA 不同的濃度，以正己烷作為參比在波長為233 nm 處測定吸收光值，將橫坐標設為CLA（g·mL-1）濃度，縱坐標設為吸光值，進而繪制CLA 標準曲線。

1.3.4 發(fā)酵液中CLA 產(chǎn)量的檢測

培養(yǎng)結束后，試管中的發(fā)酵液（5 mL）移入100 mL分液漏斗中，每管發(fā)酵液加入20 mL 正己烷振蕩萃取，靜置分層后放棄下層水相液體，加入等量蒸餾水振蕩水洗，靜置后棄去下層水相液體，水洗兩遍后，萃取液移至干凈小燒杯中，加入少量無水硫酸鈉脫去萃取液中的水分和水溶性物質，干燥至無乳化層，可消除水溶性物質對紫外檢測的干擾[6]。無水硫酸鈉經(jīng)105～110 ℃干燥3 h 后使用，將脫去水分和水溶性物質的止己烷萃取液移入25 mL 容量瓶中，加入正己烷定容，搖勻后進行紫外檢測，不能及時檢測的樣品放入4 ℃，并在24 h 內完成檢測。

以不接種的空白培養(yǎng)基為參比液，空白培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同一條件下作滅菌處理，并和接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基同時培養(yǎng)，培養(yǎng)到預定時間后，空白培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基試管同時取出進行萃取操作，空白培養(yǎng)基的萃取方法、條件和接種的發(fā)酵培養(yǎng)基相同。以空白培養(yǎng)基的正己烷萃取液為參比液，掃描后作為發(fā)酵培養(yǎng)基正己烷萃取液檢測的工作基線存入紫外檢測儀的計算機中。這樣可消除底物亞油酸、培養(yǎng)基組分在正己烷萃取液中產(chǎn)生的紫外吸收，消除這些因素對紫外檢測CLA 生成量產(chǎn)生的干擾，提高紫外檢測CLA 生成量的數(shù)據(jù)精確度和可靠性。

以空白培養(yǎng)基正己烷萃取液的紫外區(qū)吸收為工作基線，對樣品在200～350 nm 范圍內掃描，觀察在233 nm 處有無特征吸收峰。在233 nm 處有最大吸收，且吸收峰對稱者表明其發(fā)酵液中有CLA 生成，讀取233 nm 處的吸收值，根據(jù)紫外吸收標準曲線和稀釋倍數(shù)計算發(fā)酵液中CLA 生成量?？瞻着囵B(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基加入同量亞油酸，不接入菌種，其他步驟同發(fā)酵培養(yǎng)基。每次進行紫外檢測時，先將紫外分光光度計開機預熱30 min，儀器穩(wěn)定后，再放入?yún)⒈纫汉蜆悠愤M行掃描檢測，可提高檢測精度和可靠性。

1.3.5 發(fā)酵溫度對CLA 生產(chǎn)量的影響

將培養(yǎng)基選取為優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基，將已經(jīng)滅菌的容量為10 mL 的培養(yǎng)基試管接入2%的活化高產(chǎn)菌株，同時放入0.25%的亞油酸，在其他條件相同的情況下，將培養(yǎng)箱的溫度設置為30～40 ℃之間，CLA 的產(chǎn)量在培養(yǎng)24 h 后測定。最佳培養(yǎng)溫度根據(jù)CLA 的產(chǎn)量確定。

1.3.6 發(fā)酵時間對CLA 生產(chǎn)量的影響

將培養(yǎng)基選取為優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基，將已經(jīng)滅菌的容量為10 mL 的培養(yǎng)基試管接入2%的活化高產(chǎn)菌株，同時放入0.25%的亞油酸，在其他條件相同的情況下，將培養(yǎng)箱的溫度設置為30 ℃并培養(yǎng)不同的時間，最終測出CLA 產(chǎn)量，根據(jù)菌株產(chǎn)CLA 量，來確定最佳培養(yǎng)時間。

1.3.7 初始pH 值對CLA 生產(chǎn)量的影響

將培養(yǎng)基選取為優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基，將已經(jīng)滅菌的容量為10 mL 的培養(yǎng)基試管接入2%的活化高產(chǎn)菌株，同時放入0.25%的亞油酸，在其他條件相同的情況下將初始的pH 值在培養(yǎng)基中調整為5～8 之間，溫度定為37 ℃，培養(yǎng)24 h 測出共軛亞油酸的產(chǎn)量。最佳培養(yǎng)時間根據(jù)菌株產(chǎn)CLA 確定。最佳pH 值根據(jù)CLA 的產(chǎn)量確定。

1.3.8 確定培養(yǎng)條件各因素的交互影響

將培養(yǎng)pH 值、時間和溫度作為以上單因素實驗結果進行交互作用，將三種因素分別設置不同的水平，進行響應面法優(yōu)化試驗，以確定最佳條件的菌株產(chǎn)CLA 的培養(yǎng)條件，以及相互之間的關系及指標貢獻率受各種因素的影響。

2 結果分析

2.1 共軛亞油酸菌株的高產(chǎn)篩選

將配制好的CLA 標準品在正己烷為參比的條件下，采用紫外分光光度計，測定其在233 nm 處的吸光值。標準曲線的橫坐標為CLA 的濃度，縱坐標為CLA 的吸光值，CLA 紫外吸收標準曲線的線性回歸方程為y=100.69x-0.000 3，從而確定CLA 的標準曲線如圖1 所示。

圖1 共軛亞油酸標準曲線Fig.1 The standard curve of conjugated linoleic acid

通過紫外分光光度計的檢測發(fā)現(xiàn)，實驗中所選擇的7 種乳桿菌中有5 種乳酸菌在233 nm 處有紫外吸收值。在10 mL 的發(fā)酵液中，CLA 的產(chǎn)量在0.25～0.6 mg 之間，其中德式乳桿菌保加利亞亞種CLA 產(chǎn)量最高，產(chǎn)量達到0.55 mg·mL-1，因此選用德式乳桿菌作為接下來實驗的出發(fā)菌株。

2.2 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對CLA 生產(chǎn)量的影響

將培養(yǎng)基選取為優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基，將已經(jīng)滅菌的容量為10 mL 的培養(yǎng)基試管接入2%的活化高產(chǎn)菌株，同時放入0.25%的亞油酸，在其他條件相同的情況下，控制發(fā)酵時間為24 h、初始pH 為7.0，調整培養(yǎng)箱溫度為31、33、35、37、39 ℃，比較不同發(fā)酵溫度對CLA 產(chǎn)量的影響，結果如圖2 所示。

圖2 培養(yǎng)溫度對CLA 產(chǎn)量的影響Fig.2 The effects of culture temperature on CLA yield

由圖2 培養(yǎng)溫度對CLA 產(chǎn)量的影響可知，隨著培養(yǎng)溫度的增加，CLA 產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，在培養(yǎng)溫度為35 ℃時，CLA 產(chǎn)量有最大值0.267 mg·mL-1。故選擇培養(yǎng)溫度為35 ℃進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.2.2 發(fā)酵時間對CLA 生產(chǎn)量的影響

將培養(yǎng)基選取為優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基，將已經(jīng)滅菌的容量為10 mL 的培養(yǎng)基試管接入2%的活化高產(chǎn)菌株，同時放入0.25%的亞油酸，在其他條件相同的情況下，在其他條件相同的情況下，控制發(fā)酵溫度為35 ℃、初始pH 為7.0，調整培養(yǎng)時間為12、24、36、48、60 h，比較不同發(fā)酵溫度對CLA 產(chǎn)量的影響，結果如圖3 所示。

由圖3 培養(yǎng)時間對CLA 產(chǎn)量的影響可知，隨著培養(yǎng)時間的增大，CLA 產(chǎn)量呈現(xiàn)增大的變化趨勢，當培養(yǎng)時間為36 h 時CLA 產(chǎn)量有最大值0.271 mg·mL-1，當培養(yǎng)時間進一步延長，CLA 產(chǎn)量并不繼續(xù)增大，而呈現(xiàn)小幅的降低。這可能是因為CLA 的生物合成是一個動態(tài)的過程，生成的CLA 為生物氫化過程的中間產(chǎn)物，會被繼續(xù)加氫生成油酸或硬脂酸，表現(xiàn)為CLA的產(chǎn)量呈緩慢降低的趨勢[7]。

圖3 培養(yǎng)時間對CLA 產(chǎn)量的影響Fig.3 The effects of incubation time on CLA yield

2.2.3 初始PH 值對CLA 生產(chǎn)量的影響

將培養(yǎng)基選取為優(yōu)化的MRS 培養(yǎng)基，將已經(jīng)滅菌的容量為10 mL 的培養(yǎng)基試管接入2%的活化高產(chǎn)菌株，同時放入0.25%的亞油酸，在其他條件相同的情況下，在其他條件相同的情況下，控制發(fā)酵溫度為35 ℃、培養(yǎng)時間為36 h，調整初始pH 為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，比較不同發(fā)酵溫度對CLA 產(chǎn)量的影響，結果如圖4 所示。

圖4 初始pH 對CLA 產(chǎn)量的影響Fig.4 The effects of initial pH on CLA production

由圖4 初始pH 對CLA 產(chǎn)量的影響可知，隨著初始pH 的增加，CLA 產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，在初始pH 為7.0 時，CLA 產(chǎn)量有最大值0.276 mg·mL-1。故選擇初始pH 為7.0 進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.2.4 響應面優(yōu)化試驗

在單因素研究的基礎上，選取溫度、pH 和時間3個因素為自變量，以CLA 的產(chǎn)量為響應值，根據(jù)Box-Behnken 設計原理，設計響應面分析實驗，其因素水平編碼表見表1。

表1 因素編碼表Table 1 The coding table of factors

實驗應用響應面優(yōu)化法進行條件優(yōu)化。以A、B、C 為自變量，以CLA 的產(chǎn)量R 為響應值，響應面實驗方案及結果見表2。

表2 實驗設計及結果Table 2 The experimental design and results

CLA 的產(chǎn)量R 通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應面回歸模型如下：R=0.29+0.008 375A-0.011B+0.009 125C-0.008 5AB-0.002 75AC+0.003BC-0.037A2-0.038B2-0.008 025C2CLA 的產(chǎn)量R 的回歸與方差分析結果見表3。

表3 CLA 的產(chǎn)量的回歸與方差分析結果Table 3 The regression and analysis of variance results in CLA production

續(xù)表3 CLA 的產(chǎn)量的回歸與方差分析結果Continued table 3 The regression and analysis of variance results in CLA production

由表可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），并且該模型R2=97.16%，R2Adj=93.52%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F 檢驗可以得到因子貢獻率為：B＞C＞A，即pH＞時間＞溫度。

2.2.5 因素響應面分析

（1）pH 和溫度對CLA 產(chǎn)量的影響

圖5 pH 和溫度對CLA 產(chǎn)量的影響響應面圖Fig.5 pH and effects of temperature on CLA yield response surface graphs

（2）時間和溫度對CLA 產(chǎn)量的影響

圖6 時間和溫度對CLA 產(chǎn)量的影響響應面圖Fig.6 The time and temperature on CLA yield response surface graphs

（3）時間和pH 對CLA 產(chǎn)量的影響

圖7 時間和pH 對CLA 產(chǎn)量的影響響應面圖Fig.7 The effects of time and pH on CLA yield response surface graphs

應用響應面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應結果溫度為36 ℃，pH 為7，時間為42 h，響應值CLA 產(chǎn)量最優(yōu)值為0.290 mg·mL-1。

2.2.6 驗證性實驗

在響應面分析法求得的最佳條件下，即溫度為36 ℃，pH 為7，時間為42 h，進行3 次平行實驗，3 次平行實驗CLA 的產(chǎn)量的平均值為0.292 mg·mL-1。說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。

3 結論

通過發(fā)酵試驗，并以紫外可見分光光度計檢測，發(fā)現(xiàn)在實驗的7 種乳酸菌中有5 株菌發(fā)酵液的萃取液在233 nm 處有最大吸收峰。它們產(chǎn)CLA 的能力不等。其中德式乳桿菌發(fā)酵液中CLA 含量最高，達到0.055 mg·mL-1。將德式乳桿菌作為出發(fā)菌株并對對共軛亞油酸最佳培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、生長pH 的確定，利用單因素和響應面優(yōu)化分析，確定了菌種生長的最佳條件。在實驗范圍內培養(yǎng)條件對共軛亞油酸菌株生長的影響依次為PH＞時間＞溫度。應用響應面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應結果為培養(yǎng)溫度36 ℃，pH 為7，培養(yǎng)時間42 h，CLA產(chǎn)量最優(yōu)值為0.290 mg·mL-1。

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