麝香保心丸抗心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷活性成分篩選

韓 琳，呂 超，李 敏，黃慧梅，暢婉琳，彭成成，柳潤輝 (.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004；.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 5008；.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 0040)

麝香保心丸是在宋代著名方書《太平惠民和劑局方》收載的蘇合香丸的基礎(chǔ)上創(chuàng)新開發(fā)研制成功的現(xiàn)代中藥，具有芳香溫通、益氣通心之功效，主要用于治療心肌缺血引起的心絞痛、胸悶及心肌梗死，是目前國內(nèi)臨床上廣泛應(yīng)用于治療冠心病的特效復(fù)方藥物[1]。麝香保心丸由人參提取物、麝香、蟾酥、蘇合香酯、冰片、牛黃和肉桂等7味藥材組成[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明麝香保心丸具有抑制血清Tc及LDL-C的濃度升高，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜完整，抑制血管壁炎癥和內(nèi)膜增生，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，同時(shí)能改善心肌代謝，增強(qiáng)心肌能量儲(chǔ)備，促進(jìn)DNA、RNA的合成，提高機(jī)體耐缺氧能力，增強(qiáng)心肌收縮力，提高血漿環(huán)腺苷酸(cAMP)水平，抑制血小板的聚集、穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜等藥理作用[3]。

Xiang等[4]采用代謝組學(xué)方法研究了麝香保心丸對(duì)大鼠急性心肌梗死的整體藥效及作用機(jī)制，表明麝香保心丸對(duì)大鼠急性心肌梗死有治療作用，且主要通過改善心肌梗死引起的能量代謝異常、氧化損傷和炎癥等途徑對(duì)心肌梗死大鼠起到治療作用。本課題組采用血清藥物化學(xué)理論與HPLC-ESI-MS/MS和GC-MS方法相結(jié)合，分析了麝香保心丸的血中活性成分變化，共鑒定了20種血中活性成分[5,6]。本實(shí)驗(yàn)采用原代心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型，在細(xì)胞水平上對(duì)麝香保心丸及其20種血中活性成分進(jìn)行抗缺氧-復(fù)氧損傷的活性篩選，進(jìn)一步明確其保護(hù)心肌的藥效物質(zhì)。

1 材料

1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(MCD-18M，日本)；恒溫混勻儀(Eppendorf，德國)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf，Centrifuge 5810，德國)；十萬分之一電子天平(Sartorious，BP 211D，德國)；氮?dú)夤?上海天翼氣體有限公司)；酶標(biāo)儀(BioTek，ELx800，美國)。

1.2 動(dòng)物 新生1～3 d的SPF級(jí)Sprague Dawley(SD)乳鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005]。

1.3 試藥 麝香保心丸(上海和黃藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120716)。肉桂酸、肉桂醛、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸和膽酸7種對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所。人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1和麝香酮8種對(duì)照品均購自上海鼎瑞化工生物科技有限公司。冰片、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和日蟾毒他靈5種對(duì)照品均購自江西南昌貝塔生物科技有限公司。

1.4 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶(GIBCO, 美國)；雙抗(博光生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、MTT試劑(Sigma，美國)。

2 方法與結(jié)果

2.1 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)參考了Grynberg等[7]的細(xì)胞培養(yǎng)方案：用75%乙醇給乳鼠消毒后放進(jìn)超凈臺(tái)，用剪刀在乳鼠胸腔下方2根肋骨之間剪開，輕輕擠壓心臟自動(dòng)蹦出，再剪取心尖并用4℃ 預(yù)冷的PBS將心尖上的殘血洗凈并將心尖均勻剪碎。加入0.08%的胰蛋白酶置于混勻儀中以37℃、450 r/min震蕩消化心臟組織7 min。第1次消化的上清液棄去，從第2次開始到心臟組織消化完全后，將每次收集到的上清液加入到含有20% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中以終止消化。最終收集總的上清液在離心機(jī)中以1 500 r/min離心10 min，并收集心肌細(xì)胞將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，然后放于二氧化碳培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min后再將細(xì)胞懸液取出，混勻后計(jì)數(shù)。在第2～4天換液時(shí)在培養(yǎng)基中加入0.1 mmol/L的5-溴尿嘧啶以抑制成纖維細(xì)胞的生長，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖1)。

2.2 缺氧-復(fù)氧模型的建立 取長勢(shì)良好的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，以106個(gè)/ml的密度接種到96孔板中，每孔100 μl，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，換液后72 h用于實(shí)驗(yàn)。建立缺氧-復(fù)氧模型時(shí)模型組的培養(yǎng)液換成不含F(xiàn)BS的低糖培養(yǎng)基，并將二氧化碳培養(yǎng)箱的環(huán)境改成95% N2和5% CO2。在此環(huán)境下缺氧數(shù)小時(shí)后，再將培養(yǎng)液換回含20% FBS的高糖培養(yǎng)基，并回到正常條件(即95% 空氣和5% CO2，37℃)下的二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)氧數(shù)小時(shí)。參考文獻(xiàn)資料，對(duì)缺氧-復(fù)氧的時(shí)間進(jìn)行了摸索，分別是缺氧3 h復(fù)氧2 h(H3/R2)[8]，缺氧5.5 h復(fù)氧12 h(H5.5/R12)[9]以及缺氧4 h復(fù)氧12 h(H4/R12)。缺氧-復(fù)氧結(jié)束后，每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，然后在碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，再將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，每孔加入DMSO 150 μl，避光振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm下每孔的消光度值(OD值)。數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。細(xì)胞存活率(%)=造模組OD平均值/正常組OD平均值×100%。所得結(jié)果如表1所示，最終選擇H4/R12作為造模條件。

圖1 培養(yǎng)5 d后10×20顯微鏡視野里觀察到的心肌原代細(xì)胞

表1 H3/R2、H5.5/R12和H4/R12造模對(duì)比(n=48)

2.3 麝香保心丸對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 將麝香保心丸研磨成細(xì)粉狀，精密稱取4 g，用甲醇32 ml 加二氯甲烷16 ml 再加去離子水4 ml配成的混合溶劑超聲提取30 min，抽濾提取液并收集濾液，在55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制得麝香保心丸浸膏并于4℃密封保存。臨用前精密稱取2 mg，用DMSO 20 μl助溶，然后加入培養(yǎng)基配制成500 μg/ml的母液。將母液分別稀釋成30、50、100 150 μg/ml的工作液。造模前1 h給藥，各組之間平行操作。給藥組和模型組缺氧4 h復(fù)氧12 h，造模結(jié)束后，每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，然后將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，并在每孔中加入DMSO 150 μl，避光振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm下每孔的OD值。并用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如圖2所示，30、50、100、150 μg/ml均為麝香保心丸的有效劑量，其中在50 μg/ml的劑量下具有較好的抗心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷作用。

圖2 不同濃度的麝香保心丸對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響

2.4 麝香保心丸中入血成分抗心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的活性篩選 將20個(gè)入血成分精密稱取一定量，并將每個(gè)成分配成250 μmol/L的母液，分別稀釋成1、10、50 μmol/L的工作液。造模前1 h給藥，各組之間平行操作。給藥組和模型組缺氧4 h復(fù)氧12 h，空白組在正常條件下培養(yǎng)。造模結(jié)束后每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，在碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，然后將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，每孔加入DMSO 150 μl，避光振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm下每孔的OD值。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如圖3所示。20種人血活性成分中有4種成分具有顯著的保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的作用，其中人參皂苷Rb1 在10 、50 μmol/L時(shí)具有顯著的保護(hù)作用；人參皂苷Rb2 在50 μmol/L時(shí)顯示有較強(qiáng)的保護(hù)作用；蟾毒靈和麝香酮在3個(gè)濃度下都具有保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的作用，且在10、50 μmol/L時(shí)效果最佳。

3 討論

本研究采用原代心肌細(xì)胞建立缺氧-復(fù)氧模型，并對(duì)麝香保心丸及其20種人血中活性成分進(jìn)行抗心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷保護(hù)作用的篩選。研究結(jié)果表明，麝香保心丸在50 μg/ml的劑量下具有較好的抗心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的作用；20種人血中活性成分中人參皂苷Rb1、Rb2、蟾毒靈和麝香酮具有明顯的保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷作用，提示這4種成分是麝香保心丸中保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的主要有效物質(zhì)。其中已有實(shí)驗(yàn)研究表明，人參皂苷Rb1和麝香酮具有保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的作用[10-12]，與筆者的研究結(jié)果一致。本研究初步明確了麝香保心丸在細(xì)胞水平具有保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的作用及藥效物質(zhì)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供了依據(jù)。

圖3 不同濃度的人參皂苷Rb1、Rb2、蟾毒靈和麝香酮對(duì)缺氧復(fù)-氧心肌細(xì)胞存活率的影響

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