菊黃清熱散的臨床前藥效學研究

米 麗 ，陳萬生，李敬超，吳廣通(.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院藥學部，上海 00003；.武警上海總隊醫(yī)院藥劑科，上海 003)

菊黃清熱散為近年來武警上海總隊醫(yī)院自主研發(fā)和調配的院內制劑，參考臨床多年應用的驗方，采用現(xiàn)代天然藥物化學工藝濃縮制劑配伍而成，主要由中藥菊花、黃芩、川芎、白芷、桔梗、梔子、連翹、防風、蔓荊子、荊芥穗、黃連、甘草、羌活、薄荷、藁本等組成。中醫(yī)學理論認為菊黃清熱散主要用于治療表里齊熱，即中醫(yī)辨證中的“表里俱熱證”。本證為表里同病之證，于內熱之上亦感受溫邪，于表熱證外即可見面赤頭痛、惡熱口渴、咽干舌燥、心煩譫語等里熱證，與西醫(yī)的感冒和上呼吸道感染相對應?，F(xiàn)代中醫(yī)藥理論認為表里齊熱的辨證施治主要為清熱解表、散風止痛，可以歸納為抗炎、鎮(zhèn)痛等對癥治療和抗病原微生物、調節(jié)細胞免疫等對因治療。隨著中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化進程的不斷發(fā)展，經現(xiàn)代中藥藥理學實驗研究證實，菊花、黃芩、川芎等菊黃清熱散的主要藥物組分具有清熱、解表、散風、止痛等作用[1]，可用于治療惡寒發(fā)熱、頭痛鼻塞、神經性頭痛[2]、感冒頭痛、頭暈目眩、鼻淵腦痛、鼻炎及風火牙痛等。本研究對菊黃清熱散進行臨床前藥效學研究，考察其功效，同時為進一步的臨床研究提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗藥物與試劑 菊黃清熱散：每包10 g，每克浸膏含原生藥材26.8 g(上海武警總醫(yī)院藥劑科配制)，實驗前制成相應濃度的CMC-Na混懸液備用。銀翹解毒丸：長春人民藥業(yè)有限公司生產。布洛芬：橙色混懸液(100 ml:2 g)，上海強生制藥有限公司生產。醋酸潑尼松片：浙江醫(yī)藥股份有限公司生產。環(huán)磷酰胺：浙江海正藥業(yè)有限公司生產。內毒素試劑：白色粉末，美國Sigma公司生產，Sigma-L2880，10 mg。角叉菜膠：美國Sigma公司提供。伊文思藍：美國Sigma公司提供。注射用0.9%氯化鈉溶液：上海百特醫(yī)療用品有限公司生產。

1.2 實驗菌株 甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、卡他雙球菌、變形桿菌、白喉桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌均為臨床分離株。MH培養(yǎng)基，鏈球菌屬另加10%兔血，真菌培養(yǎng)采用沙氏培養(yǎng)基。

1.3 實驗動物 BABL/c及ICR小鼠(SPF級)，日本大耳兔Sprague Dawley(SD)大鼠(清潔級)，均由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

2 方法與結果

2.1 菊黃清熱散的抗病原微生物作用

2.1.1 體外抗菌作用按照試管二倍稀釋法測定藥物的最低抑菌濃度(MIC)，從1/2逐級稀釋至1/256 共8個藥物濃度，分別為800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/ml。每管內加入細菌的終濃度為105CFU/ml，最低藥物濃度的試管內無細菌生長者確定為MIC。再取MIC終點濃度以上未生長有細菌的各稀釋管內的培養(yǎng)物，分別接種在37℃培養(yǎng)皿中，無細菌生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)，結果見表1。

表1 菊黃清熱散的體外最小抑菌濃度實驗結果

2.1.2 體內抗菌作用 BABL/c小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為5組:模型組、銀翹解毒丸組、菊黃清熱散低、中、高劑量組，每組10只。除模型組外，每組給予相應藥物，均2次/d，連續(xù)給藥3 d。于末次給藥后，腹腔感染肺炎鏈球菌菌液，此后均2次/d，連續(xù)給藥3 d。觀察記錄感染后7 d內小鼠的存活數，給藥劑量及結果見表2。

2.2 菊黃清熱散的解熱作用 健康日本大耳兔測量基礎體溫，連續(xù)3 d，計算平均值。選取基礎體溫在38～39.6 ℃的家兔入選實驗組，按照體重隨機分為6個組：正常組、模型組、布洛芬組、菊黃清熱散低、中、高劑量組，每組10只。每組給予相應藥物(0.1 ml/10 g體質量)后，立即耳緣靜脈注射內毒素(0.01 ml/10 g體質量)，給藥后0.5 h測量一次直腸溫度，以后每1 h測量一次，連續(xù)測量6 h。正常組和模型組均給予等量的生理鹽水。給藥劑量及結果見表3。與正常組相比，模型組家兔在1～4 h體溫顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，菊黃清熱散中、低劑量組在給藥2、3 h時發(fā)熱家兔體溫顯著降低(P<0.05)，高劑量組2、3、4 h時顯著降低(P<0.05)，說明菊黃清熱散有一定的解熱作用。

表2 菊黃清熱散在小鼠體內抗菌作用實驗結果(n=10)

2.3 菊黃清熱散的鎮(zhèn)痛作用

表3 菊黃清熱散對內毒素所致家兔發(fā)熱的影響

2.3.1 對熱刺激引起疼痛的鎮(zhèn)痛作用 ICR小鼠，全部為雌性，55℃下熱板法篩選，取基礎痛閾值為5～30 s的小鼠進入實驗，并依據基礎痛域值分為5組。除布洛芬組外，其余每組每天給予相應藥物(0.2 ml/10 g體質量)，正常組給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥5 d。實驗第5天測量基礎痛閾值之后，各組動物給予相應藥物，測量給藥后0.75、1.5、2、3 h的痛閾值，計算痛閾反應提高百分率，給藥劑量及結果見表4。與模型組相比，菊黃清熱散高、中、低劑量組在給藥后1.5 、2、3 h使小鼠痛閾值顯著升高(P<0.05)。

痛閾反應提高百分率=

表4 菊黃清熱散對熱刺激所致疼痛的鎮(zhèn)痛作用

2.3.2 對醋酸刺激引起疼痛的鎮(zhèn)痛作用 ICR小鼠60只，雌雄各半，按體重隨機分為5組，除布洛芬組外，其余各組每天給予相應藥物(0.2 ml/10 g體重)，模型組給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥5 d。實驗第5天布洛芬組以0.2 g/kg的劑量給藥一次，各組于末次給藥后60 min腹腔注射0.6%的醋酸(0.1 ml/10 g體重)，觀察各組動物在15 min內的扭體次數。給藥劑量及結果見表5。與模型組相比，菊黃清熱散低、中、高劑量組能顯著降低小鼠扭體次數(P<0.05)，說明菊黃清熱散有一定鎮(zhèn)痛作用。

表5 菊黃清熱散對醋酸刺激引起疼痛的鎮(zhèn)痛作用

2.4 菊黃清熱散的抗炎作用

2.4.1 對角叉菜膠致足腫脹的影響 選用體質量150～200 g SD大鼠，全部為雄性，按體重隨機分為6組。連續(xù)給藥7 d，于末次給藥后即在每只鼠足趾皮下注射1%角叉菜膠混懸液0.1 ml，用特制儀器測量藥后0.5、1、2、3、4、5、6 h足趾腫脹程度，計算腫脹率，給藥劑量及結果見表6。與模型組相比，菊黃清熱散低、中、高劑量組在給藥后1、2、3、4、5 h使大鼠足趾腫脹率顯著降低(P<0.05)。

2.4.2 對腹腔毛細血管通透性的影響 ICR小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，按照體質量隨機分為5組。各組給予相應藥物(0.2 ml/10 g體質量)，于給藥后1 h，各組尾靜脈注射0.5%伊文思藍(0.1 ml/10 g體質量)，隨后立即腹腔注射0.6%的醋酸溶液(0.2 ml/只)，20 min后處死，用6 ml生理鹽水反復沖洗腹腔，洗滌液離心(3 000 r/min，15 min)，取上清液，測定吸光度A(590 nm)，給藥劑量及結果見表7。與模型組相比，菊黃清熱散低、中、高劑量組能使小鼠腹腔急性炎癥早期的血管通透性降低(P<0.05)，說明菊黃清熱散有一定的抗炎作用。

表6 菊黃清熱散對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

表7 菊黃清熱散對腹腔毛細血管通透性的影響

1)P< 0.05 ，與模型組比較

2.5 對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響 ICR小鼠60只，雌雄各半，按體重隨機分為6組，分別灌胃給藥，空白組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥10 d，在第8天，除正常對照組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(25 mg/kg)，連續(xù)3 d，末次給藥1 h后，尾靜脈注射印度墨汁稀釋液0.05 ml/10 g體重，注射后1、5 min用玻璃毛細吸管分別從眶后靜脈叢取血20 μl，溶于2 ml 0.1%NaHCO3溶液中搖勻，置分光光度計在波長650 nm下比色，測定消光度值(OD)。然后將小鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝、脾重量。按公式計算廓清指數K及吞噬指數α，給藥劑量及結果見表8。與正常組相比，模型組小鼠網狀內皮系統(tǒng)吞噬功能明顯降低，K值和α值顯著降低(P< 0.05)，給藥后，菊黃清熱散高、中劑量組K值明顯升高，α值也有一定增高(P< 0.05)，說明菊黃清熱散對網狀內皮系統(tǒng)有一定的激活作用。

表8 菊黃清熱散對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響

3 討論

感冒是一種常見病、多發(fā)病，主要是由細菌或病毒侵入上呼吸道黏膜后引起的局部炎癥反應[3]，導致發(fā)熱、鼻塞、咽部疼痛等一系列癥狀[4]。西醫(yī)治療感冒以對癥治療為主，同時加以抗菌藥物，但是具有解熱鎮(zhèn)痛作用的西藥易引起較嚴重的不良反應，如胃腸道反應和肝毒性等，因而其臨床使用受到限制。

菊黃清熱散為名老中醫(yī)驗方，有疏散風熱止痛之功。傳統(tǒng)中醫(yī)藥對于感冒相關病癥整體辨證，在調節(jié)人體免疫力的基礎上發(fā)揮抗病毒作用。中醫(yī)理論中將感冒分為風熱、風寒、暑濕、秋燥、時行、體虛等多種辨證類型[5]，其中以“風熱”和“風寒”最為常見。菊黃清熱散組分中含有菊花、黃芩、川芎等藥物成分，主疏解風熱、解表散風，也可提氣安神。其適應證主要為表里俱熱、提氣安神等功效，亦可兼顧其他類型。依據菊花清熱散的成分及臨床前實驗觀察可見，其主要對風熱型感冒起到標本兼治的作用，對于其他類型感冒患者也可增強機體免疫，提高御病能力。

本實驗項目的選擇參考菊花清熱散的適應證建立，常見的風熱感冒癥狀包括鼻塞、流涕、咳嗽、頭痛等一般感冒卡他癥狀，以及以咽痛、黃痰、發(fā)熱為主的風熱型感冒癥狀。其病癥主要表現(xiàn)為機體整體或局部的炎性反應，或者以感冒早期即可出現(xiàn)的咽痛、喉干、肢體酸痛等前列腺素相關疼痛和炎癥，現(xiàn)代醫(yī)學一般認為黃痰是由咽部黏膜損傷導致的繼發(fā)性細菌感染。根據現(xiàn)代中藥藥理學模型建立的標準：達到中藥可發(fā)揮治療效果的現(xiàn)代醫(yī)學疾病病理階段評價指標的同時符合主治癥狀與辨證相符[6]，筆者依照風熱感冒常見和特有

的病癥，對應現(xiàn)代醫(yī)學具有評價指標的主治癥狀，從解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌4個方面進行了實驗設計與評價，同時考慮到制劑組分中可能存在的免疫調節(jié)作用使用碳粒廓清法評價了網狀內皮系統(tǒng)相關的免疫學指標。

據報道，黃芩苷具有抗炎和解熱的作用，而野黃芩苷和甘草的抗炎作用機制與黃芩苷相同[7]，也是通過抑制前列腺素的合成而減輕炎癥反應[8,9]。單核-巨噬細胞是機體抗感染免疫的主要效應細胞。在機體受到感染后，單核-巨噬細胞可識別并吞噬病原體，殺傷、清除病毒和細菌等；也可通過分泌細胞因子、趨化因子等介導和促進炎癥反應，增強機體的免疫應答。此外，單核-巨噬細胞還能清除機體中損傷、衰老的細胞，在免疫監(jiān)視中起重要作用[10]。

有研究表明，防風、人參、黨參等均對單核-巨噬細胞系統(tǒng)有促進作用，從而增強機體的免疫功能[11]。

這與本實驗中菊黃清熱散提高廓清指數(K)及吞噬指數(α)，對網狀內皮系統(tǒng)有一定的激活作用一致。

綜上所述，本研究提示菊黃清熱散具有抗菌、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、調節(jié)免疫的作用，為菊黃清熱散臨床治療神經性頭痛、感冒頭痛、頭暈目眩、鼻淵腦痛、鼻炎及風火牙痛等癥狀提供科學依據。

【參考文獻】

[1] 王 杰，魏 超，呂曙華. HPLC法測定芎菊上清丸中綠原酸[J]. 中草藥，2006,37(7)：1032-1033.

[2] 牛 俐，鄭紅梅，趙 英. 芎菊上清丸配合心理疏導治療偏頭痛52例[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2005,17(1)：40.

[3] 楊愛霞，阮金蘭，王曉仙，等. 退熱解毒靈顆粒的解熱抗炎作用[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2012,32(3)：170-172.

[4] 武月萍，張建剛. 中藥灌腸劑治療小兒外感發(fā)熱215 例臨床觀察[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012,39(14)：3520-3522.

[5] 張風清，吳碧珍，王牡丹. 風寒感冒和風熱感冒的鑒別與治療[J]. 內蒙古中醫(yī)藥,2012,31(8): 16.

[6] 陳 艷，蔡小軍. 病癥結合藥理模型的研究思路[J]. 實用藥物與臨床,2012,5(8): 516-518.

[7] Fu Y, Chen J, Li Y,etal. Antioxidant and anti-inflammatory activities of six flavonoids separated from licorice[J]. Food Chem，2013, 141(2):1063-1071.

[8] Siracusa L, Saija A, Cristani M,etal. Phytocomplexes from liquorice (GlycyrrhizaglabraL.) leaves-chemical characterization and evaluation of their antioxidant, anti-genotoxic and anti-inflammatory activity[J]. Fitoterapia，2011,82(4):546-556.

[9] Cho H, Lim S, Lee Y,etal. Hexane/ethanol extract ofGlycyrrhizauralensislicorice exerts potent anti-inflammatory effects in murine macrophages and in mouse skin[J]. Food Chem,2010, 121(4):959-966.

[10] 馬洪第，盧芳汀，陶艷艷，等. 中藥免疫調節(jié)作用的研究進展[J]. 臨床肝膽病雜志，2011，27(5)：462-466.

[11] 仇微紅，郭世寧,李志華，等. 中藥免疫調節(jié)作用的研究進展[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技,2008,33(2): 9-13.