胰腺癌細胞S100A4基因DNA甲基化及表達的研究

李建峰 周國雄 丁曉凌 張海峰 曹維 瞿利帥 張弘 徐正府 邢恬

胰腺癌是惡性程度較高、預(yù)后較差的惡性腫瘤，發(fā)病率在國內(nèi)外呈上升趨勢。S100A4蛋白具有促進細胞增生和新生血管生成、抑制細胞凋亡、重塑細胞外基質(zhì)、增加細胞外基質(zhì)的運動能力、降低細胞間的黏附力等多種促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的功能。隨著對該基因蛋白結(jié)構(gòu)、功能和編碼基因進一步深入的研究，S100A4蛋白有可能成為患者預(yù)后的腫瘤標記物和惡性腫瘤的診斷指標。在多種惡性腫瘤中S100A4基因存在啟動子區(qū)域高度甲基化現(xiàn)象，但其在胰腺癌中的甲基化變化國內(nèi)尚未見報道。本研究旨在探討S100A4基因在胰腺癌細胞株中的甲基化水平。

一、材料和方法

1．胰腺癌細胞株培養(yǎng)：人胰腺癌細胞株SW1990、BxPC3和PANC1購自中國科學院上海生命科學研究所，常規(guī)傳代培養(yǎng)。3個正常胰腺組織來自南通市公安局法醫(yī)處。

2．S100A4基因的甲基化狀態(tài)檢測： 采用重亞硫酸鹽測序(BSP)聯(lián)合TA克隆測序檢測S100A4基因甲基化狀態(tài)。分別收集適量的胰腺癌細胞和適量的正常胰腺組織，采用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取癌細胞及組織DNA；采用甲基化修飾試劑盒(Qiagen公司)修飾提取的DNA；采用DNA PCR試劑盒(TaKaRa公司)對修飾好的DNA進行擴增。S100A4啟動子引物正義序列 5′-GGTTGAGTTATGTATATTGGGTGGT-3′，反義序列 5′-TACCCATAACAAAAAACAAAAAAA-3′，擴增產(chǎn)物205 bp。S100A4第一內(nèi)含子引物正義序列5′-GTTGGGGAAGGAGAAGGG-3′，反義序列 5′-CCTACTCCCGAATACGCAAC-3′，擴增產(chǎn)物300 bp。PCR產(chǎn)物聯(lián)合TA克隆測序由Invitrogen公司協(xié)助完成。

3．S100A4 mRNA表達的檢測：采用RT-PCR方法檢測S100A4 mRNA表達。 分別收集適量胰腺癌細胞和正常胰腺組織，按Trizol試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度。按BioRT Two step RT-PCR kit說明書完成cDNA的合成和PCR反應(yīng)。S100A4引物正義序列5′-CCCTGGATGTGATGGTGTC-3′，反義序列 5′-CTCGTTGTCCCTGT TG CTG-3′，擴增產(chǎn)物185 bp；內(nèi)參GAPDH引物正義序列5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反義序列5′-AGGGCCATCCACAGTCTTC-3′， 擴增產(chǎn)物258 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，凝膠成像分析儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示mRNA相對表達量。

4．S100A4蛋白表達的檢測：分別收集適量的胰腺癌細胞和正常胰腺組織，裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度。取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測S100A4蛋白的表達，最后EC化學發(fā)光，X膠片曝光、顯影，Bio-Rad軟件掃描，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度比值表示蛋白相對表達量。實驗重復5次，取均值。

二、結(jié)果

1．PCR擴增產(chǎn)物及測序結(jié)果：胰腺癌細胞株及正常胰腺組織均擴增出第一內(nèi)含子的300 bp片段及啟動子的205 bp片段(圖1) ，部分克隆的測序結(jié)果見圖2(引物、CpG位點用下劃線標出)。

圖1 S100A4第一內(nèi)含子(上)及啟動子(下)的擴增片段

BxPC3、SW1990、PANC1細胞及3例正常胰腺組織中S100A4第一內(nèi)含子的甲基化頻率分別為44.0%、8.0%、0、84.0%、100%、88.0%；啟動子的甲基化頻率分別為53.3%、6.7%、23.3%、86.7%、100%、90.0%。正常胰腺組織S100A4基因的甲基化頻率很高，胰腺癌細胞S100A4基因的甲基化頻率較低，其中SW1990及PANC1細胞的甲基化頻率更低。

2．S100A4 mRNA及蛋白表達：BxPC3、SW1990、PANC1細胞S100A4 mRNA相對表達量分別為0.294±0.134、0.664±0.230、0.580±0.241，3例正常胰腺組織均無S100A4 mRNA表達(圖3)。其中PANC1、SW1990細胞的表達量較高，BxPC3細胞的表達量較低，這與它們的啟動子及第一內(nèi)含子的甲基化水平相對應(yīng)。

胰腺癌細胞株BxPC3、SW1990、PANC1中S100A4蛋白相對表達量分別為0.558±0.237、1.279±0.742、1.101±0.675，其中SW1990及PANC1細胞的表達量較高，BxPC3細胞的表達量較低；3例正常胰腺組織均未見S100A4蛋白表達(圖4)。

圖2 PANC1細胞啟動子(a)、SW1990細胞第一內(nèi)含子(b)、胰腺組織啟動子(c)及第一內(nèi)含子(d)擴增片段的測序圖

圖3 胰腺癌細胞及正常胰腺組織的S100A4 mRNA表達

圖4 胰腺癌細胞及正常胰腺組織S100A4蛋白的表達

討論Rosty等[1]通過基因芯片及免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織S100A4基因過表達。魯林源等[2]報道，胰腺癌組織S100A4的表達與腫瘤TNM分期、腫瘤大小及預(yù)后不良有著較為密切的關(guān)系。Oida等[3]報道，原發(fā)性胰腺癌S100A4基因表達陽性率達78%，其表達與腫瘤臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)，而且可能是預(yù)測預(yù)后的獨立因子。Cho等[4]檢測了124例結(jié)直腸癌標本，發(fā)現(xiàn)S100A4在癌組織中過表達，而在正常直腸組織中微弱表達或不表達；S100A4的過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke′s分期有關(guān)。de Silva Rudland等[5]研究發(fā)現(xiàn)，S100A4表達于乳腺癌細胞的胞質(zhì)和癌細胞周圍的小血管內(nèi)皮細胞，S100A4表達陽性患者的生存時間明顯縮短。Min等[6]檢測198例甲狀腺微小乳頭狀癌組織S100A4的表達，發(fā)現(xiàn)微小乳頭狀癌組織S100A4的表達可以預(yù)測潛在的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。另有文獻報道，94%的大腸癌[7]、41%的乳腺癌[8]、55%的胃癌[9]、25%的食管鱗狀細胞癌[10]組織的S100A4基因過表達。

Rosty等[1]研究了S100A4基因DNA甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞株和胰腺癌組織中S100A4基因的表達與S100A4第一內(nèi)含子的低甲基化有關(guān)，采用5-氮雜-2′-脫氧胞使胰腺癌Hs766T細胞去甲基化可誘導該細胞S100A4再表達。本研究結(jié)果顯示，正常胰腺組織S100A4基因不表達，而3株胰腺癌細胞株S100A4基因均表達。應(yīng)用克隆測序方法進一步證實正常胰腺組織S100A4基因啟動子及第一內(nèi)含子的甲基化頻率均在80%以上，甚至達100%。而3株胰腺癌細胞S100A4基因啟動子及第一內(nèi)含子的甲基化頻率較低，甚至無甲基化。胰腺癌細胞S100A4基因表達量與它們的基因甲基化程度有關(guān)，即表達量與甲基化頻率呈負相關(guān)，這可能為胰腺癌的基因干擾治療提供新的靶點。

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