脂多糖對AR42J細胞Toll樣受體7、9表達的影響

張露藝 唐國都 唐曦平 梁志海 詹媛

急性胰腺炎(AP)是一種炎癥性疾病，胰膽管結(jié)石、飲酒、暴飲暴食、病毒感染等是常見的病因。這些病因?qū)е乱认僮陨硐?，胰腺實質(zhì)細胞損傷，發(fā)生變性壞死，在胰腺內(nèi)形成無菌性炎癥[1]。Toll樣受體家族(Toll like receptor，TLR)是機體固有免疫的重要部分，組成機體對抗炎癥的第一道防線。研究報道[2]，Toll樣受體家族與AP發(fā)病的病理生理關(guān)系密切，但其具體作用機制尚未闡明。本研究應(yīng)用脂多糖刺激正常大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J，構(gòu)建AP體外細胞模型，觀察細胞TLR7、TLR 9表達的變化，探討其在AP發(fā)病機制中的作用。

材料和方法

一、細胞培養(yǎng)及模型建立

大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J購自美國ATCC(American type culture collection)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取傳代2次且生長良好的對數(shù)生長期細胞，以1×106個細胞/孔接種到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，分別加入含1、10、100 mg/L脂多糖(Sigma公司)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，以不加脂多糖的細胞作為對照組。收集培養(yǎng)上清液和細胞備用。實驗重復(fù)3次。

二、細胞TLR7、TLR9 mRNA表達的檢測

采用RT-PCR法檢測。應(yīng)用Trizol(Omega公司)抽提各組細胞總RNA。先應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermenta公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用RT-PCR方法檢測TLR7、TLR9 mRNA表達。TLR7引物上游為5′-CCACCGAATCTAACGACTCTCT-3′，下游為5′-ACAAACCACACAGCATCACAGT-3′，擴增產(chǎn)物365 bp；TLR9引物上游為5′-GCTGTCAATGGCTCTCAGTTC-3′，下游為5′-GGGAGGTAGTTGAGGTTCTGG-3′，擴增產(chǎn)物425 bp；內(nèi)參GAPDH引物上游為5′-CATGGTCTACATGTTCCAGT-3′，下游為5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′，擴增產(chǎn)物349 bp。引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件： 95℃ 4 min，95℃ 30 s、 60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，由凝膠成像系統(tǒng)掃描測量條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示mRNA相對表達量。

三、細胞TLR7、TLR9蛋白表達的檢測

應(yīng)用總蛋白提取試劑盒(碧云天公司)提取細胞總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒(碧云天公司)測蛋白濃度。取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測TLR7、TLR9蛋白表達量，以β-actin為內(nèi)參。兔抗大鼠TLR7多抗購自Cell Signaling公司，小鼠抗大鼠TLR 9單抗購自Imgenex公司，山羊抗兔及山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗購自Santa Cruz公司。TLR7、TLR9、β-actin一抗工作濃度分別為1∶1 000、1∶500、1∶8 000，二抗?jié)舛葹?∶10 000。最后ECL化學(xué)發(fā)光，膠片曝光、顯影，圖像分析儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

四、培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-10含量測定

收集造模后24 h各組細胞培養(yǎng)上清液，離心取上清，應(yīng)用ELISA試劑盒(武漢博士德公司)檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-10含量，按試劑盒說明書操作。最后上酶標(biāo)儀測各孔450 nm波長的吸光度值(A450值)。以標(biāo)準(zhǔn)品的A450值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣本的濃度。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組AR42J細胞TLR7、TLR9 mRNA及蛋白表達的變化

各組細胞均有TLR7、TLR9 mRNA及蛋白表達。與對照組相比，脂多糖處理的3組細胞的TLR7、TLR9 mRNA的表達量隨脂多糖濃度升高而增加，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為37.36、21.59，P值均<0.01，表1、圖1)；3組細胞的TLR7、TLR9蛋白的表達量亦隨脂多糖濃度升高而增加，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為33.48、23.19，P值均<0.01，表1、圖2)。

表1 各組細胞TLR7、TLR9 mRNA及蛋白的表達量

圖1 對照組(1)及1、10、100 mg/L脂多糖處理組(2、3、4)細胞TLR7、TLR9 mRNA表達

圖2 對照組(1)及1、10、100 mg/L脂多糖處理組(2、3、4)細胞TLR7、TLR9蛋白表達

二、各組細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-10含量的變化

對照組及1、10、100 mg/L脂多糖處理組細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量分別為(8.01±5.32)、(25.64±8.71)、(49.06±10.23)、(75.83±6.65)ng/L，隨脂多糖濃度升高逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.24，P<0.01)；IL-10含量分別為(155.54±25.47)、(105.16±10.49)、(69.36±8.19)、(14.07±9.06)ng/L，隨脂多糖濃度升高而逐漸下降，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=60.94，P<0.01)。

討 論

細胞損傷時從胞內(nèi)釋放到胞外的物質(zhì)稱為損傷相關(guān)性分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，包括熱休克蛋白(HSPs)、高遷移率族蛋白(HMGB1)、DNA、RNA等[3]。DAMPs通過TLR、NOD樣受體等模式識別受體，在炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。由于DAMPs可與病原微生物一樣激活上述受體，所以DAMPs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)亦稱為“無菌性炎癥”。胰腺腺泡細胞的自身消化是AP發(fā)生的早期事件，損傷細胞釋放DAMPs，在局部產(chǎn)生無菌性炎癥，再通過炎癥遞質(zhì)的瀑布級聯(lián)反應(yīng)，使炎癥擴大化，甚至發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征。因此，DAMPs的受體TLR在AP發(fā)病機制中的作用日益成為研究熱點之一。

TLR是機體固有免疫的重要組成，屬于Ⅰ型跨膜受體，分為識別配體的膜外區(qū)、跨膜區(qū)及膜內(nèi)高度保守的TIR結(jié)構(gòu)，配體為病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)和DAMPs[4]。TLR7、TLR9是細胞內(nèi)的TLR家族成員，靜息時位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，識別配體時轉(zhuǎn)移到內(nèi)體膜上[5]。TLR7識別病原體單鏈RNA(ssRNA)[6]，TLR9識別病原體非甲基化DNA(CpG DNA)[7]。近年來研究顯示，TLR7、TLR9可分別識別自身RNA和自身DNA介導(dǎo)炎癥效應(yīng)[8]。文獻報道，TLR7、TLR9激活后可以通過依賴MyD88信號的通路募集下游信號分子，使Iκ-B降解、激活、釋放NF-κB，NF-κB進入細胞核后，調(diào)控下游炎癥遞質(zhì)的表達，放大炎癥效應(yīng)[9]。其中TNF-α是炎癥反應(yīng)的啟動遞質(zhì)，可上調(diào)促炎細胞因子IL-β、IL-6及自身的表達，介導(dǎo)胰腺局部和全身炎癥反應(yīng)[10]。IL-10是一種重要的炎癥負反饋調(diào)節(jié)細胞因子，可以抑制TNF-α、IL-β、IL-6的生成[11]。細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α濃度升高，IL-10濃度降低，說明炎癥不斷加重。

脂多糖亦稱為內(nèi)毒素，已證實其參與AP的病理生理[12]。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可直接損傷胰腺腺泡細胞，使胰腺炎相關(guān)蛋白和促炎細胞因子表達升高，細胞DNA斷裂，細胞凋亡[13]。

本研究以正常大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J為實驗對象，用不同濃度脂多糖處理細胞構(gòu)建AP體外細胞模型。結(jié)果顯示，處理后AR42J細胞的TLR7、TLR9 mRNA及蛋白的表達呈濃度依賴性升高，同時細胞培養(yǎng)上清液中促炎細胞因子TNF-α亦呈濃度依賴性升高，而炎癥負反饋調(diào)節(jié)細胞因子IL-10則呈濃度依賴性下降，提示TLR7、TLR9表達在AP的炎癥效應(yīng)中可能發(fā)揮促炎作用，與Hoque等[14]的研究結(jié)果相同。推測其機制為脂多糖處理后可致胰腺腺泡細胞損傷，釋放包括自身RNA及DNA在內(nèi)的細胞內(nèi)容物，分別被TLR7、TLR9識別后，再通過依賴MyD88的信號通路募集下游信號分子，激活NF-κB,誘導(dǎo)炎癥遞質(zhì)合成[15]，產(chǎn)生局部的無菌性炎癥，并通過炎癥遞質(zhì)放大炎癥效應(yīng)。

參 考 文 獻

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