舒血寧聯(lián)合奧曲肽對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腦損傷的保護(hù)作用

王小紅 魏榮龍 儲(chǔ)磊 胡江鴻 沈云志

重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)腦損傷，又稱胰性腦病(pancreatic encephalopathy，PE)，是SAP常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為定向力障礙、意識(shí)模糊、幻覺(jué)等精神狀態(tài)異常。臨床SAP并發(fā)PE約占同期患者的18.2%，病死率達(dá)67.0%。

目前PE的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，而胰酶作用學(xué)說(shuō)及炎癥遞質(zhì)作用學(xué)說(shuō)得到廣泛關(guān)注[1]。本研究應(yīng)用舒血寧及奧曲肽治療急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)腦損傷大鼠，觀察兩者聯(lián)合的療效，探討其可能的作用機(jī)制。

一、資料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雄性遠(yuǎn)交系大鼠180只，體質(zhì)量250～305 g，鼠齡43～49 d，購(gòu)自南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、ANP組、舒血寧組、奧曲肽組、舒血寧和奧曲肽聯(lián)合處理(聯(lián)合)組及陽(yáng)性對(duì)照的烏司他丁組，每組30只。?；悄懰徕c(95%)購(gòu)自Sigma公司；舒血寧為石家莊神威藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)Z13020795；奧曲肽為瑞士諾華制藥有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20090924；烏司他丁為廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H19990132。參照Kaplan等[2]方法采用胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g體質(zhì)量方法制備大鼠ANP并發(fā)腦損傷模型。造模后6 h，舒血寧組大鼠經(jīng)股靜脈注射舒血寧0.5 ml/100 g體質(zhì)量(配方：5%葡萄糖液250 ml+舒血寧注射液20 ml+普通胰島素3U)，每日1次；奧曲肽組皮下注射奧曲肽0.5 μg/100 g體質(zhì)量，每6 h 1次；聯(lián)合組分別給予舒血寧0.5 ml/100 g體質(zhì)量，每日1次，奧曲肽0.5 μg/100 g體質(zhì)量，每6 h 1次(不混合)；烏司他丁組給予靜脈注射烏司他丁1 ml/100 g體質(zhì)量(配方：0.9%氯化鈉500 ml+烏司他丁10萬(wàn)U)，每8 h 1次。對(duì)照組開(kāi)腹輕觸摸胰腺后關(guān)腹，術(shù)后6 h給予等容積生理鹽水，每天1次。

給藥后即刻(造模后6 h)、造模后24 h分兩批處死各組大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，置-20℃冰箱保存，取胰腺組織，乙醛固定，取腦組織，液氮冷凍保存。

2．血清磷脂酶A2(PLA2)、TNF-α、IL-6含量測(cè)定：采用陳氏法[3]測(cè)定PLA2，采用放射免疫法檢測(cè)TNF-α、IL-6含量。TNF-α、IL-6放免試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

3．胰腺病理學(xué)檢查：胰腺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、HE染色，由?？漆t(yī)師盲法在光鏡下閱片，并參照Schmidt等[4]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分。

4．腦組織含水量測(cè)定：從液氮中取出后稱腦濕重，然后置于真空恒溫干燥箱100℃烘烤24 h。稱干重，計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

5．腦組織病理學(xué)及電鏡檢查：取部分新鮮腦組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查，由?？漆t(yī)師盲法在光鏡下閱片，參照孔雷等[5]方法進(jìn)行病理評(píng)分。腦組織電鏡標(biāo)本制作及觀察由南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專業(yè)老師指導(dǎo)進(jìn)行。

6．腦組織TNF-α、IL-6 mRNA檢測(cè)：采用RT-PCR法檢測(cè)。TNF-α、IL-6及內(nèi)參GAPDH的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列：TNF-α 正義為 5′-CGCCACCGGCAAGGATTCCA-3′，反義為5′-TCCCAACGCTGGGTCCTCCA-3′，產(chǎn)物335 bp；IL-6正義為5′-CAAGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′，反義為5′-TTGCCGAGTAGACCTCATAGTGACC-3′，產(chǎn)物614 bp；內(nèi)參GAPDH正義為5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反義為5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′，產(chǎn)物239 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，循環(huán)35次，再72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，用凝膠成像儀掃描，Image J軟件分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．大鼠存活率：各組大鼠6 h內(nèi)均無(wú)死亡。24 h時(shí)ANP組9只死亡，存活率40%；舒血寧組7只死亡，存活率53.3%；奧曲肽組6只死亡，存活率60%；聯(lián)合組3只死亡，存活率80%；烏司他丁組5只死亡，存活率66.7%。其中聯(lián)合組與ANP組24 h存活率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0302)。

2．血清PLA2、TNF-α、IL-6水平及腦組織含水量、TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)量：各實(shí)驗(yàn)組6、24 h時(shí)血清PLA2、TNF-α、IL-6水平，腦組織含水量，TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量均較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。然而，各實(shí)驗(yàn)組6 h點(diǎn)的各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而24 h時(shí)舒血寧組、奧曲肽組、聯(lián)合組、烏司他丁組各指標(biāo)均較ANP組顯著下降，其中聯(lián)合組又較舒血寧組、奧曲肽組、烏司他丁組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1)。

表1 各組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較

3．胰腺病理、腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)變化：ANP組6 h時(shí)鏡下見(jiàn)胰腺腺泡水腫，脂肪液化，間質(zhì)顯著增寬，小葉間隙增大，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胰腺局灶或片狀出血壞死，24 h時(shí)胰腺破壞更嚴(yán)重，大量腺泡消失，出血壞死區(qū)域擴(kuò)大，殘存部分小葉組織(圖2)。6 h時(shí)鏡下見(jiàn)腦組織內(nèi)多處神經(jīng)元細(xì)胞水腫，氣球樣變，小血管和毛細(xì)血管充血，多灶性毛細(xì)管擴(kuò)張及出血，血管周圍水腫，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管內(nèi)白細(xì)胞聚集及附壁，24 h時(shí)損傷更明顯(圖3)；透射電鏡下見(jiàn)腦神經(jīng)元的染色質(zhì)邊集，核仁消失，胞質(zhì)水腫，細(xì)胞內(nèi)容減少，線粒體腫脹，空泡變性，核膜破裂，間質(zhì)水腫和程度不等的脫髓鞘改變,24h時(shí)的病理改變更明顯(圖4、5)。

討論本研究結(jié)果顯示，ANP組6 h時(shí)胰腺組織及腦組織均出現(xiàn)病理?yè)p傷，腦組織含水量增加，提示存在腦損傷，表明ANP并發(fā)腦損傷的模型成功建立。

圖1 6、24 h時(shí)ANP組(1,2)、舒血寧組(3,4)、奧曲肽組(5，6)、聯(lián)合組(7,8)、烏司他丁組(9,10)、對(duì)照組(11,12)大鼠腦組織TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)

圖2 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠胰腺組織病理改變(HE ×400)

圖3 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦組織病理改變(HE ×200)

圖4 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變(×10000)

圖5 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變(×15000)

文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，PLA2、TNF-α及IL-6等因子與ANP相關(guān)性腦損傷密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ANP組大鼠血清PLA2、TNF-α、IL-6水平、腦組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸增加，提示PLA2、TNF-α及IL-6均參與ANP相關(guān)性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

舒血寧注射液是第四代的銀杏葉提取物，主要有效成分為黃酮苷類和萜烯內(nèi)酯類活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理證明，舒血寧注射液能減輕全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)時(shí)多器官的缺血再灌注損傷，清除自由基、拮抗血小板活化因子、抑制白細(xì)胞活化，減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，起到保護(hù)多臟器功能的作用[11]。奧曲肽是一種人工合成的八肽環(huán)狀化合物，具有與天然內(nèi)源性生長(zhǎng)抑素類似的作用，但作用較強(qiáng)且持久，半衰期較天然生長(zhǎng)抑素長(zhǎng)30倍。奧曲肽具有抑制胰腺外分泌，減少胰酶含量；松弛Oddi括約肌，保持胰液引流通暢；抑制細(xì)胞因子的生成和炎癥介質(zhì)的釋放，并通過(guò)刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)而減輕內(nèi)毒素血癥，抑制炎癥反應(yīng)等作用[12]。本研究結(jié)果顯示，舒血寧組及奧曲肽組與陽(yáng)性對(duì)照的烏司他丁組一樣，均能降低ANP大鼠血清PLA2、TNF-α、IL-6水平、腦組織含水量及TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量，減輕胰腺及腦組織的病理?yè)p傷。聯(lián)合應(yīng)用舒血寧及奧曲肽的作用較單獨(dú)用藥的作用更顯著，值得在臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

參 考 文 獻(xiàn)

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