Rho-GDI2在胰腺癌中的表達及其臨床意義

易彬 張逸 周健 宋世鐸 趙鑫 李德春

Rho-鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPases)蛋白家族，包括RhoA、RAC1和Cdc42，具有調控一系列調節(jié)生物過程的信號通路、參與促進所有腫瘤的惡性生物學行為等作用[1-2]。

鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子2(Rho-GDP dissociation inhibitor2，Rho-GDI2)作為Rho-GTPases蛋白家族的重要調節(jié)因子之一，通過調節(jié)Rho-GTPases蛋白家族的分布及活性狀態(tài)，從而影響細胞的分裂、形態(tài)改變、遷移及侵襲能力、血管侵犯等生物學行為[1,3-5]。然而，關于Rho-GDI2的表達與胰腺癌臨床病理參數(shù)間的關系鮮見報道。本研究檢測胰腺癌及配對癌旁組織中Rho-GDI2的表達，分析胰腺癌組織Rho-GDI2表達與臨床病理參數(shù)間的關系，探討Rho-GDI2在胰腺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、實驗材料

收集2006年至2012年蘇州大學附屬第一醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理證實的60例胰腺癌及其配對癌旁組織，部分用甲醛固定，部分置液氮罐凍存后轉入-80℃冰箱保存。Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司，Master MixPCR擴增試劑盒購自美國Promega公司，兔抗人Rho-GDI2多抗購自英國Abcam公司,山羊抗兔二抗購自碧云天生物技術(上海)有限公司。PCR引物采用PremierPrimer 5．0軟件設計，由美國Invitrogen公司合成。

二、方法

1．RNA提取和RT-PCR：取20例新鮮凍存胰腺癌組織及配對癌旁組織，用Trizol提取總RNA，隨后用AMV逆轉錄試劑盒合成cDNA，再行RCR擴增。引物序列：Rho-GDI2上游5′-ATGACTGAAAAAGCCCCA-3′，下游5′-TCATTCTGTCCACTCCTT-3′。內參β-actin上游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游5′-CAGGGTACATGGTGGTGCTGCC-3′。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動成像儀拍照，灰度掃描，使用Quantity One軟件分析，以目的基因條帶與β-actin條帶灰度值比表示mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

2．免疫組織化學染色：固定的組織經(jīng)石蠟包埋、切片，行常規(guī)免疫組織化學染色。Rho-GDl2一抗及二抗工作濃度1∶50稀釋，最后DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明和封片。染色的組織切片由兩名病理科醫(yī)師盲法讀片。結果判斷：以細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，染色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計0、1、2、3分，陽性著色面積按無著色及著色面積<1/3、1/3～2/3、>2/3分別計0、1、2、3分，將兩項得分相加，>3分為表達陽性。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、胰腺癌及配對癌旁組織Rho-GDI2 mRNA表達

20例胰腺癌組織及相應癌旁組織中Rho-GDI2 mRNA表達量分別為0.661±0.021、0.199±0.023(圖1)，癌組織顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(F=26.313，P<0.01)。

圖1 胰腺癌(T)及配對癌旁組織(NT)Rho-GDI2 mRNA的表達

二、胰腺癌及配對癌旁組織Rho-GDI2蛋白表達

Rho-GDI2陽性染色主要定位于細胞胞質內，少部分陽性染色定位于胞核(圖2)。胰腺癌組織Rho-GDI2陽性表達率為73.3%(44/60)，且陽性染色多呈棕黃色或棕褐色；配對癌旁組織的陽性表達率為41.7%(25/60)，且陽性染色多呈淡黃色。胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.310，P=0.001)。

圖2 胰腺癌組織(a)及癌旁組織(b)中Rho-GDI2蛋白的表達 (免疫組化 ×400)

三、胰腺癌組織Rho-GDI2表達與臨床病理參數(shù)的關系

胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白表達與患者性別、年齡及腫瘤部位無相關性，而與腫瘤大小、分化程度、病理分期、淋巴結轉移、血管侵犯等具有相關性(表1)。

表1 胰腺癌組織Rho-GDI2的表達與臨床病理參數(shù)的關系

討 論

Rho-GDIs作為Rho-GTPases蛋白家族的重要調節(jié)因子，目前被確認的有3種：Rho-GDI1(也稱作Rho-GDI或Rho-GDI-a)、Rho-GDI2(也稱為Ly-GDI或D4GDI或Rho-GDI-β)、Rho-GDI3(也稱為RhoGDI-γ)[6-8]。Rho-GDI1表達于哺乳類動物的各臟器，Rho-GDI3表達于大腦、肺臟、腎臟、睪丸以及胰腺，Rho-GDI2一直以來被認為特異性地表達于造血組織。近來研究發(fā)現(xiàn)Rho-GDI2在非造血組織腫瘤中也表達[9-11]。

Rho-GTPases家族有兩種結合狀態(tài)：(1)激活狀態(tài)：與GTP結合，定位于細胞膜，接受、傳遞、處理相應的信號刺激；(2)失活狀態(tài)：與GDP結合，定位于細胞質中，不能接受、傳遞、處理信號刺激。RhoGDI2通過抑制GDP與Rho-GTPases的解離，與大多數(shù)Rho-GTPases結合于細胞質中，使Rho-GTPases處于失活狀態(tài)，阻止其與效應分子相互作用，因此，Rho-GDI2最初被認定為Rho-GTPases蛋白家族的負調控因子。然而最近的研究表明，Rho-GDI2也可以與Rho-GTPases結合于細胞膜，通過抑制Rho-GTPases本身的GTPase活性以及GTPase激活蛋白(GAPs)的GTP酶活性，維持Rho-GTPases與GTP結合的激活狀態(tài)，對Rho-GTPases蛋白家族起正調控作用[12-15]。

腫瘤組織Rho-GDI2表達與其臨床病理參數(shù)及患者預后關系的研究結果在不同腫瘤中不一致。有研究報道，Rho-GDI2表達水平與膀胱癌患者生存率呈正相關，且是膀胱癌轉移及預后的獨立預測因子[16]。乳腺癌患者的無病生存率和無遠處轉移生存率與Rho-GDI2的表達呈負相關，提示Rho-GDI2高表達有促乳腺癌轉移的作用，是患者預后差的標記[17]。Rho-GDI2 mRNA低表達與胃癌淋巴結轉移及大腸癌肝轉移呈正相關，高表達Rho-GDI2的腫瘤患者有著更長的無腫瘤復發(fā)生存期[18-19]。

本研究結果顯示，胰腺癌及癌旁組織均有Rho-GDI2的表達，但癌組織的陽性表達率顯著高于相應配對癌旁組織，癌組織Rho-GDI2 mRNA表達量也顯著高于配對癌旁組織。胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白表達與患者性別、年齡及腫瘤部位無相關性，而與腫瘤大小、分化程度、病理分期、淋巴結轉移、血管侵犯等相關，提示Rho-GDI2的表達與胰腺癌的轉移密切相關。

參 考 文 獻

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