胰腺癌患者血清代謝組學(xué)研究

楊鳴 錢維 董昕 楊帆 朱偉 張永鎮(zhèn) 李兆申 蔡全才

胰腺癌患者一旦確診多已進(jìn)入晚期轉(zhuǎn)移階段[1]，因此提高胰腺癌早期診斷的效率是改善預(yù)后的關(guān)鍵。然而目前應(yīng)用于臨床的胰腺癌診斷方法在敏感性和特異性方面還存在相當(dāng)局限性[2-4]。腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理變化造成機(jī)體基礎(chǔ)代謝產(chǎn)生相應(yīng)變改，最終造成與正常個(gè)體之間代謝譜的差異[5]。代謝產(chǎn)物作為新的生物學(xué)標(biāo)志物，也許是一種有效的腫瘤早期診斷的工具[6]。本研究應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)分析胰腺癌與正常人血清間的差異代謝物，尋找可以作為胰腺癌早期診斷的特異性標(biāo)志物。

材料和方法

一、研究對(duì)象

本研究設(shè)計(jì)采用病例對(duì)照成組分析方法，以病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌患者作為病例組，健康人群為對(duì)照組。胰腺癌患者為2013年6月到2013年10月長海醫(yī)院肝膽胰脾外科住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)同意參加本課題研究；(2)必須為初診病例；(3)經(jīng)病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌；(4)能獲得治療前空腹靜脈血標(biāo)本；(5)能調(diào)查獲得有關(guān)暴露信息；(6)年齡≥35歲；(7)漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他腫瘤、高血壓、冠心病、肝硬化、腎功能不全、代謝性疾病、血液病等；(2)過去2周內(nèi)使用過抗生素、激素、非甾體消炎藥等；(3)過去2周內(nèi)有重大應(yīng)激反應(yīng)，采血前接受過放療、化療者；(4)6個(gè)月內(nèi)有輸血史。對(duì)照組為長海醫(yī)院體檢中心體檢健康的人群。

二、血清代謝組學(xué)檢測

取患者入院后治療前和對(duì)照組人群晨起空腹靜脈血2 ml，30 min內(nèi)離心分離血清。取100 μl血清，加300 μl甲醇和乙腈混合溶液(V∶V=2∶1)混勻，置4℃ 10 min， 4℃ 13 000 r/min離心15 min，取上清液4 μl上高效液相色譜單級(jí)四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC/Q-TOF MS)。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC@HSS T3(1.8 μm， 100 mm×2.1 mm)。先用含5%乙腈的0.1%甲酸平衡柱子，上樣后繼續(xù)用該液洗脫2 min，然后用含95%乙腈的0.1甲酸分別洗脫17、19 min，流速0.4 ml/min，壓限值800 bar(壓強(qiáng)單位，1 bar=105Pa)，柱溫40℃。電噴霧離子源頭為正、負(fù)離子檢測模式(正離子ESI+，負(fù)離子ESI-)。正離子模式：干燥溫度350°C，氣體流量1 L/min，霧化器45 psi(磅/英寸2)，毛細(xì)管電壓4 000 V，裂解電壓120 V，分離機(jī)電壓160 V，八級(jí)桿RF峰電壓750 V，參照質(zhì)量121.0509 m/z、922.0098 m/z；負(fù)離子模式：干燥溫度350°C，氣體流量1 L/min，霧化器45 psi，毛細(xì)管電壓3 000 V，裂解電壓120 V，分離機(jī)電壓160 V，八級(jí)桿RF峰電壓750 V，參照質(zhì)量112.985587 m/z、1033.988109 m/z。

將所有對(duì)照人群的血清混合，制備為質(zhì)控樣品(QC)。在進(jìn)行序列分析之前，連續(xù)進(jìn)樣6次QC，以確定系統(tǒng)的重復(fù)性。在序列分析中，每隔9個(gè)樣品進(jìn)樣一次QC，以確定系統(tǒng)的穩(wěn)定性。通過將QC的質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)重疊，直觀地判斷儀器在分析樣本時(shí)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

三、數(shù)據(jù)提取及預(yù)處理

在R軟件平臺(tái)下采用XCMS程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號(hào)(峰識(shí)別和積分)，然后進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析(質(zhì)譜碎片歸屬)，最后在EXCEL軟件中進(jìn)行后期編輯。將結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(保留時(shí)間RT，質(zhì)荷比m/z)、觀察量(樣本)和峰值強(qiáng)度，并且對(duì)所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件(11.0版本)，進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析。

多變量數(shù)據(jù)分析首先采用主成分分析(principal componem analysis, PCA)模型，即無監(jiān)督模式識(shí)別，以觀察各組樣本之間的總體分布，進(jìn)行數(shù)據(jù)的聚類及去除離群樣本，確定儀器穩(wěn)定性。然后用偏最小二乘方判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)模型，即有監(jiān)督模式識(shí)別，返回各變量的變量權(quán)重(variable importance on projection，VIP)值。VIP值>1.0被認(rèn)為變量對(duì)該模型有較大影響。為了獲取差異更加明顯的變量，本研究只選擇了VIP值>1.5的變量[7]。每個(gè)PLS-DA模型都生成一個(gè)S-plot可視化載荷圖，對(duì)模型影響程度越大的變量，其協(xié)方差和相關(guān)系數(shù)越大。為防止PLS-DA模型的過度擬合，采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)方法來評(píng)估模型質(zhì)量。

四、差異代謝物篩選及鑒定

選擇VIP值>1.5，并在S-plot中具有較大相關(guān)性和協(xié)方差的變量篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量。通過將這些差異代謝物的m/z與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，如數(shù)據(jù)庫HMDB (http://www.hmdb.ca)、METLIN (http://metlin.scripps.edu)和 KEGG (http://www.kegg.jp)等進(jìn)行比對(duì)，初步確認(rèn)差異物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式，然后根據(jù)得到的分子式以及質(zhì)譜/質(zhì)譜(MS/MS)裂解譜圖，再與數(shù)據(jù)庫比對(duì)以進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)，最后還要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的RT、m/z及MS/MS結(jié)果確定差異代謝物。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、入選研究對(duì)象

共納入胰腺導(dǎo)管腺癌患者及健康者108例。為減小由疾病本身以外的因素引起的代謝誤差，兩組以1∶1配對(duì)，各54例，年齡±3歲、性別相匹配。胰腺癌組及健康對(duì)照組男∶女比例均為39∶15，胰腺癌組年齡平均為(57±7)歲,健康對(duì)照組為(58±7)歲。

二、系統(tǒng)的穩(wěn)定性

儀器檢測所得到的正、負(fù)離子的總離子流圖的重合圖見圖1。譜峰重疊良好，表明系統(tǒng)的重復(fù)性及穩(wěn)定性均符合實(shí)驗(yàn)要求，數(shù)據(jù)比較可靠。

三、PCA模型結(jié)果

正離子模式下，兩個(gè)相互正交的主成分PC1和PC2能夠體現(xiàn)原始數(shù)據(jù)集中的70.7%(解釋率R2=0.707)和預(yù)測原始數(shù)據(jù)集中的29.0%的方差(預(yù)測率Q2=0.29)。負(fù)離子模式下兩個(gè)相互正交的主成分PC1和PC2能夠體現(xiàn)原始數(shù)據(jù)集中的60.1%(R2=0.601)和預(yù)測原始數(shù)據(jù)集中的42.8%的方差(Q2=0.428)。兩個(gè)離子模式數(shù)據(jù)建立的PCA模型的解釋率均較好(R2均>0.5)，但預(yù)測率的效能較差。

圖1 QC在正(a)、負(fù)(b)離子模式下的總離子流圖重合圖

四、PLS-DA模型結(jié)果

正離子模式下R2=0.941，Q2=0.861；負(fù)離子模式下R2=0.93，Q2=0.824，說明PLS-DA正、負(fù)離子兩模式的解釋率及預(yù)測率均較高(均>0.5)，兩組樣本分別在不同區(qū)域，相對(duì)集中(圖2)。相應(yīng)排序檢驗(yàn)(RPT)結(jié)果示正、負(fù)離子模式Q2回歸直線與Y軸的截距均小于0(正離子模式Q2截距為-0.117，負(fù)離子模式為-0.0825)，說明兩PLS-DA模型可靠。

a:正離子模式；b:負(fù)離子模式

五、潛在代謝標(biāo)志物的篩選

胰腺癌與健康者的血清經(jīng)篩選后共有12種差異代謝物(表1)。其中羥基花生四烯酸(HETE)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、乙酰肉堿(Acetylcar-nitine)、亞油酸(Linoleic acid)、棕櫚酰肉堿(Palmitoylcarnitine)、亞油醇肉堿(Linoleyl carnitine)、尿嘧啶脫氧核苷酸(dUMP)和甘氨鵝脫氧膽酸(Glycochenodeoxycholic acid 3-glucuronide)8種代謝產(chǎn)物在胰腺癌患者血清中水平高于正常人群(t或z值分別為7.76、6.99、3.64、2.43、5.89、5.41、6.51、4.6，P值均<0.05)，溶血磷脂酰膽堿[LysoPC(18∶0)]、LysoPC(P-16:0)、溶血磷脂酸[LPA(18∶2/0∶0)]、LysoPC(14∶0)4種代謝產(chǎn)物在胰腺癌患者血清中水平低于正常人群(t或z值分別為13.3、6.96、6.45、5.48，P值均<0.05)。HETE、LysoPC(18∶0)、Phenylalanine、LPA(18∶2/0∶0)、dUMP的AUC值均高于CA19-9的AUC值0.90(表2)。

討 論

近來一些胰腺癌血清代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)血清差異代謝物建立的胰腺癌診斷模型區(qū)分力及準(zhǔn)確度都很高[8-9]。以一系列血清氨基酸組合作為診斷模型，其對(duì)胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群鑒別診斷價(jià)值高，ROC曲線下體積(volume under ROC surface，VUS)達(dá)到0.891(95%CI0.794～0.968)，甚至超過CA19-9[9]。Kobayashi等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，以血清木糖醇、1,5-脫水-D-葡萄糖醇、組氨酸和肌醇組合對(duì)胰腺癌和正常人群鑒別診斷的敏感度和特異度可以分別達(dá)到86.0%和88.1%。

表1 胰腺癌患者和健康者血清的差異代謝物

表2 胰腺癌患者和健康者血清差異代謝物峰值強(qiáng)度及AUC(95%CI)

本研究應(yīng)用UHPLC/Q-TOF MS為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)技術(shù)檢測胰腺癌、正常人群血清間的代謝組差異，篩選出12種有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異血清代謝物，其中5個(gè)差異血清代謝產(chǎn)物[HETE、LysoPC(18∶0)、苯丙氨酸、LPA(18∶2/0∶0)、dUMP]的AUC大于CA19-9的AUC。

本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清LysoPC較健康人群顯著下降，特別是LysoPC(18∶0)和LysoPC(P-16∶0)的下降更顯著。與之前報(bào)道的胰腺癌[10-11]及其他惡性腫瘤，如肝癌[12]、腎細(xì)胞癌[13]等代謝組學(xué)研究結(jié)果相似。LysoPCs通過磷脂酰膽堿經(jīng)磷脂酶A2水解形成，同時(shí)LysoPCs在溶血磷脂酶D的作用下水解生成溶血磷脂酸(LPA)。LysoPCs和LPA在細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞的侵襲和炎癥反應(yīng)等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[14]。Fang等[10]發(fā)現(xiàn)，大鼠胰腺癌組織磷脂酰膽堿和甘油磷酸膽堿水平比正常胰腺組織降低，原因可能是膽堿酶和磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶被抑制和(或)磷酸膽堿經(jīng)由胞苷二磷膽堿代謝途徑大量消耗所致[15-16]。胰腺癌患者血清LysoPCs和LPA的降低有可能是惡性腫瘤致患者炎性反應(yīng)激活而導(dǎo)致本身PC水平降低或磷脂酶A2、溶血磷脂酶D活性的抑制所引起[17]。

本研究結(jié)果表明，乙酰肉堿、棕櫚酰肉堿、亞油醇肉堿3種肉堿類代謝產(chǎn)物及亞油酸在胰腺癌患者血清的水平顯著升高。肉堿在細(xì)胞中主要通過參與3條脂質(zhì)代謝通路發(fā)揮維持細(xì)胞正常狀態(tài)的功能，分別是促進(jìn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體，幫助除去短鏈和中鏈脂肪酸以及維持膜磷脂的循環(huán)更新[18]。脂肪酸在氧供給充足的條件下經(jīng)β-氧化產(chǎn)生能量。胰腺癌患者血清中這些脂質(zhì)生物成分的升高可能是由于細(xì)胞膜合成和細(xì)胞增殖活動(dòng)的增強(qiáng)導(dǎo)致的能量需求增加[19]。?；鈮A在游離脂肪酸氧化過程中起關(guān)鍵作用，它負(fù)責(zé)將乙酰輔酶A運(yùn)送至線粒體內(nèi)。胰腺癌患者血清?；鈮A的升高可能由于胰腺癌患者線粒體內(nèi)脂肪酸β-氧化活動(dòng)的上調(diào)[19]。

HETE在胰腺癌患者血清中低于正常人血清，區(qū)分兩者的AUC均達(dá)到98%，與Urayama等[20]的研究結(jié)果相同。HETE是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在脂加氧酶(lipoxygenase，LOXs)的催化下形成的，它進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為白三烯。近來大量研究結(jié)果表明，AA代謝終產(chǎn)物與腫瘤的病理形成和發(fā)展有密切的關(guān)系，LOX在胰腺癌中高表達(dá)，其中5-HETE與12-HETE通過激活P44/22有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3/AKT激酶途徑可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)DNA合成[21-23]。

本研究結(jié)果還顯示， HETE、LysoPC(18∶0)、苯丙氨酸、LPA(18∶2/0∶0)、dUMP的AUC均大于CA19-9，提示這些差異代謝物是潛在的診斷標(biāo)志，可能在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中有重要的生物學(xué)意義。本研究結(jié)果需要在更多的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證它們作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

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