卵粘蛋白的糖鏈解析及構效關系研究進展

付丹，馬美湖，蔡朝霞，金永國，黃茜

（國家蛋品加工技術研發(fā)分中心，華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢 430070）

蛋白質的糖基化修飾是最廣泛、最復雜、最重要的翻譯后修飾之一，糖蛋白廣泛分布于生命體中，有超過50%的蛋白質都發(fā)生了糖基化修飾。糖蛋白上的糖鏈是重要的信息分子，承載著數倍于核酸蛋白的生物信息，因而其被認為是繼核酸鏈與蛋白質鏈之后，與生命活動息息相關的第三鏈。雞蛋中的卵粘蛋白就是一種糖基化程度超過30%的高分子量硫酸酯糖蛋白。1898年Eichlolz首次從雞蛋蛋清中分離出卵粘蛋白[1]。卵粘蛋白主要分布在禽蛋蛋清中，占蛋清總蛋白質含量的2%～4%[2]，此外，在系帶和卵黃膜外層中也有分布。蛋清中的卵粘蛋白與溶菌酶和其它蛋白質等形成復合物而存在[3-4]。卵粘蛋白對維持蛋清粘稠性和凝膠結構起重要作用。禽蛋貯藏過程中常會發(fā)生蛋清由粘稠狀態(tài)變?yōu)橄”∷畼訝顟B(tài)的蛋清稀化現(xiàn)象，許多研究者認為卵粘蛋白復合物的降解有關[5-7]。

1 卵粘蛋白的分離純化

1.1 等電點沉淀法

等電點沉淀法是目前最常用的制備卵粘蛋白的方法。主要是利用不同蛋白質等電點不同，目標蛋白質在其等電點處溶解度最低而沉淀下來，從而達到分離蛋白質的目的。等電點沉淀法主要包括蛋白質的沉淀、富集和洗滌三個步驟。由于卵粘蛋白通常與溶菌酶或其它蛋白質以復合物形式存在。溶液中的離子可通過靜電屏蔽降低卵粘蛋白與其它蛋白質之間的靜電相互作用。

傳統(tǒng)方法采用高濃度KCl溶液制備卵粘蛋白，主要操作為蛋清與水以1∶3混合并攪拌，調溶液pH為6.0使卵粘蛋白沉淀出來，然后用2%KCl反復洗滌除去卵粘蛋白中的溶菌酶，最后經水洗后得到卵粘蛋白[8]。但是有研究表明KCl洗滌會造成卵粘蛋白的損失[9]。因此，Omana and Wu用NaCl代替KCl提出了兩步提取法制備卵粘蛋白的新方法[10]。該法第一步用100 mM NaCl可最大限度地除去卵白蛋白，同時使卵粘蛋白沉淀出來，第二步用500 m M NaCl除去溶菌酶制得卵粘蛋白粗品。同時，他們通過比較不同濃度的CaCl2和KCl提取卵粘蛋白，證實了用KCl制得的卵粘蛋白純度和提取率都較低[11]。表1比較了用KCl、CaCl2、NaCl制備的卵粘蛋白樣品的蛋白質組成和提取率，研究數據顯示，采用CaCl2或NaCl配合兩步提取法能顯著提高卵粘蛋白的提取率。此外，若用NaCl三步連續(xù)等電點沉淀法制卵粘蛋白，也能達到純度和提取率較高的符合一般實驗要求的卵粘蛋白[12]。

表1 KCl、CaCl2、NaCl制備的卵粘蛋白樣品的蛋白質組成和提取率Table 1 Protein composition and yield of ovomucin samples prepared by KCl，CaCl2，NaCl

一般而言，金屬鹽的加入會不同程度地破壞蛋白質的高級結構，從而影響蛋白質生理活性，但有研究表明Mg2+不僅可以降低卵粘蛋白和溶菌酶之間的相互作用，還有助于維持蛋白質構象的穩(wěn)定，使蛋白質保持良好的生物活性。Shan yuanyuan等先用50 mM CaCl2再用50 mM MgCl2制卵粘蛋白，其純度高達（97±0.47）%，提取率為（407.95±3.62）mg/100 g 蛋清[13]，且MgCl2的加入提高了卵粘蛋白的抗雞新城疫病毒血凝抑制活性。由于等電點沉淀法制備的卵粘蛋白多為不溶性的，因此，等電點沉析法常與超聲、超濾和離心法結合使用提高蛋白溶液的溶解度[14-16]。值得一提的是即使采用相同的方法，不同研究者在不同條件下制備的卵粘蛋白的純度和提取率也會存在差別。

等電點沉淀法制備卵粘蛋白由于成本低、方法簡單、操作方便，是制備卵粘蛋白粗提物最常用的方法，同時對于實現(xiàn)卵粘蛋白的工業(yè)化大量生產具有十分重要的意義。

1.2 色譜法

色譜法因分離效率高，選擇性好，是分離純化生物大分子的過程中是不可缺少的方法，且常采用液相色譜。該法分離純化卵粘蛋白最大優(yōu)點是可得到純度高且為可溶性的蛋白質；但每次操作卵粘蛋白得到的量較少，局限于實驗室分析時采用。目前已運用于卵粘蛋白提純的主要是凝膠色譜、離子交換色譜和親和層析色譜。

1.2.1 凝膠色譜

凝膠色譜是利用凝膠的網狀結構根據分子的大小和形狀進行分離的方法。與蛋清中其它蛋白質相比，卵粘蛋白的分子量很大，可使其最先洗脫下來，從而實現(xiàn)分離。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。Young和Gardenr采用Sepharose 4B凝膠過濾色譜從蛋清中分離卵粘蛋白，可較清楚地將卵粘蛋白與蛋清中其他蛋白質分離開來[17]。為了最大的保持卵粘蛋白的原有性質，用含1.0%SDS的Sepharose 4B可分離得到純度較高且可溶性的卵粘蛋白[18]。Hiidenhovi等研究發(fā)現(xiàn)將2個Sephacryl S-400 HR串聯(lián)的凝膠過濾色譜能較好地提高分離出的卵粘蛋白亞基的分辨率及分離效率[19]。

1.2.2 離子交換色譜

離子交換色譜以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物質的衍生物為載體，根據蛋白質分子在一定的pH和離子強度條件下所帶電荷的差異實現(xiàn)分離純化，該技術已經成功用于分離大多數水溶性蛋白質，包括水解以后的多肽乃至氨基酸。當流動相pH合適時還能維持蛋白質的生物活性[20]。Yokota等利用超聲波處理溶解卵粘蛋白，再用DEAE-cellulose離子交換色譜制備具有生物活性的卵粘蛋白亞基研究卵粘蛋白抗腫瘤活性[21-22]。

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Awadé等采用凝膠滲透色譜、反相高效液相色譜和陰離子交換高效液相色譜三種方法分離純化雞蛋中的蛋白質，發(fā)現(xiàn)凝膠滲透色譜可有效地實現(xiàn)卵粘蛋白與溶菌酶的分離，但對雞蛋中其它蛋白質的分離效果不佳。采用反相高效液相色譜可實現(xiàn)對除卵粘蛋白外的其它蛋白質的分離。陰離子交換色譜的分辨率最高且蛋白質的回收率較好，但由于卵粘蛋白在低離子強度的溶液中是不溶解的，因此不適合用陰離子交換色譜分離[23]。

1.2.3 親和色譜

親和色譜主要是利用生物分子與配體特異性地結合實現(xiàn)分離的技術。Kato等利用卵粘蛋白與溶菌酶、卵白蛋白特異性結合，采用溶菌酶-瓊脂糖4B親和色譜、卵白蛋白-瓊脂糖4B親和色譜分離純化卵粘蛋白，發(fā)現(xiàn)色譜柱上的卵白蛋白不能與溶菌酶有效結合，每毫升溶菌酶-瓊脂糖4B凝膠可吸附2 mg卵粘蛋白，能較好的分離出卵粘蛋白[24]。

1.3 聚乙二醇沉淀法

近年來，聚乙二醇（PEG）常被用于生物活性物質的提取中，具有維護蛋白質的生物活性、改善蛋白質溶解度，提高蛋白質產量等優(yōu)勢；采用聚乙二醇法沉淀蛋白質主要利用了聚乙二醇對蛋白質的空間排斥作用使得蛋白質按照其分子量從大到小依次沉淀出來達到分離效果。Geng等采用聚乙二醇沉淀法分步提取雞蛋蛋清中的蛋白質，由于卵粘蛋白分子量最高，使得它最先被沉淀下來[25]。

2 卵粘蛋白的糖鏈解析

根據糖基化修飾發(fā)生的位點及糖鏈連接方式的不同，糖蛋白及相應糖鏈主要分為N-糖鏈和O-糖鏈兩大類。前者是糖鏈與蛋白Asn-X-Thr/Ser序列中Asn殘基上的-NH2相連，X為除脯氨酸以外的任意氨基酸殘基；后者則是糖鏈與蛋白Ser/Thr殘基上的-OH相連。

研究發(fā)現(xiàn)，卵粘蛋白由ɑ、β 2個亞基構成，亞基之間以二硫鍵相連[26-28]。ɑ-亞基（包括 ɑ1-、ɑ2-）含糖量相對較低，約為11%～15%（質量比）；β-亞基含糖量相對較高，約為50%～57%（質量比），它們的平均相對分子質量分別為220 kDa、400 kDa。ɑ-亞基主要含酸性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸，β-亞基主要含羥基氨基酸如蘇氨酸、絲氨酸。糖鏈上的低聚糖有己糖（甘露糖、半乳糖）、氨基己糖（N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺）、N-乙酰神經氨酸和硫酸酯。

卵粘蛋白作為一種與凝膠形成有關的蛋白質與生物體內粘蛋白在遺傳上有一定的聯(lián)系：β-亞基的編碼基因與人MUC6具有同源性[29]，而ɑ-亞基包含2 087個氨基酸序列，該亞基由N-端、高度糖基化的中心區(qū)域及C-端3部分構成，對應的氨基酸序列為D1-D2-D’-D3-R-D4-C1-CK（CK 為胱氨酸結），其 N-端氨基酸序列與hpp-vWF基因區(qū)域（human pre-pro-von Willebrand factor）和人體MUC2基因同源度分別為33%、41%；C-端則分別為 30%、38%[30]。

由于糖蛋白生物合成的非模板性和結構的微不均一性，使糖蛋白具有更多的分支結構、連接方式和空間構象，目前階段還不能在完整糖蛋白的水平上對糖鏈的詳細結構進行研究，而需先從多肽骨架上釋放寡糖鏈，再進一步研究寡糖鏈的結構特點。鑒于此，現(xiàn)階段對糖鏈結構研究并不多。Strecker等對雞蛋中的卵粘蛋白經堿性硼氫化鈉的β消去反應釋放O-糖鏈，經乙醇洗脫分離純化后得到三個主要低聚糖醇OL-1，OL-2和OL-3，用FAB-MS和1H-NMR分析其結構。OL-1 結構為：Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcolβ1-3Gal；OL-2 結 構 為 Galβ1-4Glc （6-O-SO3H）NAcβ1-6GalNAc-olβ1-3Gal，OL-3 結構為 Galβ1-4Glc（6-O-SO3H）NAcβ1-6GalNAc-olβ1-3Galɑ2-3NeuAc[31]。

單媛媛等采用傅里葉變換紅外光譜和二維紅外相關分析研究溫度變化對卵粘蛋白構象的影響時發(fā)現(xiàn)糖鏈構象對溫度的耐受能力比肽鏈低，糖鏈分子的存在有利于維持蛋白構象的穩(wěn)定。卵粘蛋白從25℃升溫至95℃或100℃加熱過程，蛋白分子鏈的構象發(fā)生相應的變化，在達到55℃～65℃時的改變較大。熱處理過程中，卵粘蛋白的二級結構的變化次序為α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則結構[33]。

3 卵粘蛋白糖鏈及其構效關系

糖蛋白上的糖鏈就好像細胞表面的天線，在糖蛋白與病毒、腫瘤、細菌等的相互作用中起細胞識別、細胞粘附、細胞免疫等多種生理功效。卵粘蛋白構效所體現(xiàn)的生物活性與其糖鏈結構密切相關。

3.1 糖鏈與抗病毒侵染活性

許多病毒的囊膜表面具有能夠凝集多種動物或人紅細胞的血凝素，因而常用紅細胞凝集評價病毒活力，用紅細胞凝集抑制試驗檢測某特異性抗體抑制病毒的紅細胞凝集能力。Gottschalk和Lind發(fā)現(xiàn)卵粘蛋白與豬流感病毒相互作用釋放糖肽復合物可抵御豬流感病毒引起的血凝反應[33]。后來的研究發(fā)現(xiàn)，卵粘蛋白還對雞新城疫病毒（NDV）、牛輪狀病毒（RV）和人流感病毒（HIV）也有較高的親和力和血凝抑制活性[34]。Shan yuanyuan等采用紅細胞凝集抑制實驗和酶聯(lián)免疫實驗也證實了卵粘蛋白與NDV的相互作用[12-13]。大量研究表明，宿主細胞表面的糖蛋白或糖脂糖鏈末端的唾液酸是流感病毒血凝素浸染細胞時的特異性受體。對于卵粘蛋白的抵御病毒的能力已有研究表明可能是其糖鏈末端的唾液酸分子發(fā)揮了重要作用[35-37]。

3.2 糖鏈與抗腫瘤活性

蛋白質上的糖鏈可以調節(jié)受體與配體間的相互作用，具有刺激腫瘤細胞的迅速增殖、介導腫瘤細胞的粘附、侵襲等重要生理功能。粘蛋白糖鏈的變化對于臨床上鑒定各種疾病特別是腫瘤診斷有重大的意義。

E-鈣粘蛋白作為一種跨膜糖蛋白，有研究表明上皮E-鈣粘蛋白結合的N-糖鏈結構的改變和平分型N-乙酰氨基葡萄糖基糖鏈的增加可抑制黑色素瘤細胞的轉移[39]。此后的大量研究也表明E-鈣粘蛋白是一種抑癌和侵襲轉移抑制的糖蛋白。此外，有人發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白Asn633位點上的N-糖基化對E-鈣粘蛋白的折疊、運輸和表達具有重要作用[40]。Xia等研究O型糖基化的生物學功能時采用血管內皮細胞特異型T-synthase即C1β3Gal-T基因敲除小鼠進行實驗，首次揭示了O型聚糖core 1上Galβ1-3GalNAc參與了血管新生過程[41]。

卵粘蛋白作為禽蛋中一種重要的糖蛋白，其抗腫瘤活性也備受關注，在實驗室研究中，多采用酶解獲得卵粘蛋白亞基或糖肽，再與腫瘤細胞作用測定卵粘蛋白的抗腫瘤活性[42-44]。本課題組左思敏等對近年來有關卵粘蛋白與腫瘤細胞的相互作用研究進行了比較全面的闡述，綜述分析了卵粘蛋白抗腫瘤機制主要是抑制新生血管的生成、細胞毒效應誘導細胞凋亡和激活免疫系統(tǒng)等[45]。目前有關卵粘蛋白與腫瘤細胞的相互作用大多以該蛋白質的亞基片段或糖肽為主要研究對象，糖鏈在其中發(fā)揮的作用及作用機制還有待深入研究。

3.3 糖鏈與抗菌活性

已有研究表明粘蛋白具有不同程度的抗菌作用。胃粘蛋白是由上皮細胞分泌的高度糖基化和高分子量的糖蛋白，在生物體內具有保護胃壁免受化學、微生物、酶以及機械性的損傷的生理功能，同時也具有一定的抵抗幽門螺旋桿菌的能力[46]。已有研究表明粘液糖蛋白帶有負電荷，由各種長度的復合低聚糖肽核心組成，互相形成膠狀結構，有利于包繞細菌[47]。Kawakubo等研究顯示，胃粘蛋白的中的O型糖鏈似乎像天然抗菌素一樣具有抗幽門螺桿菌的抗菌活性，可保護宿主免受幽門螺旋桿菌侵入與感染[48]。此外，有報道稱腺粘液中存在的N-乙酰葡糖胺具有抑制幽門螺旋桿菌增殖并使之變形的功能。微生物入侵宿主的第一步是粘附，大量研究表明，唾液粘蛋白的碳水化合物成分在微生物的非免疫性清除中起主要作用，唾液中粘蛋白對細菌的凝集作用而有助于細菌的清除。馬玉龍等在研究肉雞不同部位腸粘液糖蛋白與雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、禽大腸桿菌O78、大腸桿菌ATCC 25922、雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的相互作用時，發(fā)現(xiàn)不同細菌在不同的腸道部位均與肉雞腸粘液糖蛋白有一定的粘附作用[49]。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)糖鏈中 GalNAcβ1-4Gal、GalNAcβ1-3Gal、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-4GlcNAc糖單元能有效地抑制銅綠假單胞菌對粘蛋白粘附[50-51]。Schroers等研究了鯉魚腸道粘蛋白分子量大小和糖鏈對其與細菌粘附性的影響時發(fā)現(xiàn)粘蛋白與細菌的粘附性與分子量相關，粘蛋白的糖側鏈和糖骨架核心對粘附性起重要作用[52]。

Kobayashi等在研究卵粘蛋白糖肽（OPG）對食源性細菌的粘附作用時，根據生物素-親和素-酶特異性結合，在微量滴定板中用生物素標記的病原體作為探針，用堿性磷酸酶標記親和素測定OPG對食源性細菌（蠟樣芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌、大腸桿菌O157：H7、李斯特菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）的結合能力，并采用凝集素檢測細菌與OPG結合位點。研究結果顯示，OPG僅與食源性大腸桿菌O157：H7作用且結合部位是糖肽上含糖區(qū)域的唾液酸[53]。同時，Ryoko等將卵粘蛋白用絲氨酸酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解，得到分子量為2.0 kDa～70.0 kDa的產物，發(fā)現(xiàn)這些酶解產物對食源性病原菌（腸毒性大腸桿菌、芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和假單胞菌等）具有很強的抑制作用[54]。為了評價卵粘蛋白對食品中常見的3種污染菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌）的抗菌性能，單媛媛等采用體外實驗檢測了卵粘蛋白抗菌活性及其穩(wěn)定性，研究表明該蛋白對不同細菌的抗菌活性有較顯著的差異，對大腸桿菌和沙門氏菌抑制作用較強，最小抑菌質量濃度分別為0.05 mg/mL和0.4 mg/mL，而對金黃色葡萄球菌則無明顯的抑制作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同溫度和酸堿環(huán)境對卵粘蛋白抑菌穩(wěn)定性也有不同的影響[55]。

3.4 其它生物活性

Sorensen等的研究則表明當MUC1粘蛋白分子上的5個O糖基化位點被糖基化時，糖肽抗原能誘發(fā)免疫反應[56]。這說明了粘蛋白的糖鏈參與了機體的免疫調節(jié)。

最新研究表明，卵粘蛋白經微生物蛋白酶（復合蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶）水解后得到的多肽具有良好的抗氧化作用[57]。

部分研究表明，膽結石的形成與粘蛋白有密切關系，膽汁中成核效應蛋白體系活性失衡是膽石形成的重要因素之一。成核效應蛋白大多為糖蛋白，其中糖鏈起著調節(jié)活性的作用。項建斌等在研究膽汁成核活性蛋白中糖鏈在膽石形成時發(fā)現(xiàn)將成核效應糖蛋白上的糖鏈和多肽分別酶解時該蛋白的成核活性喪失，其結果顯示糖鏈參與成核效應蛋白的致石作用過程[58]。此外有研究表明人體中的MUC2粘蛋白是重要的促成核因子，也是參與構成膽固醇結石有機網狀結構的主要蛋白之一[59]。Nagaoka等采用體外實驗和Caco-2細胞模型證實空腸上皮細胞中膽固醇混合膠束與卵粘蛋白的相互作用可能抑制膽固醇的吸收，同時，卵粘蛋白也可通過抑制膽汁酸在回腸的重吸收來達到降低血清膽固醇的目的[60]。鑒于以上研究顯示卵粘蛋白與膽固醇的作用也可能與其結構中的糖鏈有關，這有待進一步研究證實。

4 討論與展望

由于糖蛋白中糖鏈序列的多樣、合成的非模板性等現(xiàn)象的存在，使糖鏈的結構比蛋白質要復雜得多，因而糖蛋白糖鏈的解析存在一定的困難，特別是對像卵粘蛋白這樣的高度糖基化同時分子量極高的粘蛋白糖鏈解析需要解決的問題就更多。雖然已有報道卵粘蛋白的糖與氨基酸種類及含量，但對它們的結構、空間構象等方面的解析遠遠不夠。運用現(xiàn)代分析技術對卵粘蛋白的蛋白質部分和糖鏈部分全面的解析將為人們全面卵粘蛋白提供有力的支撐。

糖蛋白組學認為，糖蛋白的生物功能不僅與蛋白質有關，糖鏈也發(fā)揮了不可替代的作用。生物活性與糖鏈的組成及其結構密切相關。眾所周知，唾液酸與發(fā)育、炎癥、病原感染等諸多生理和病理過程密切相關，在人類健康和疾病中起重要作用。卵粘蛋白糖鏈含有相對較多的唾液酸，是否這些唾液酸具有如上功能以及發(fā)揮作用的機制等這些問題都值得研究者深入思考。此外，已有大量研究表明硫酸酯化多糖具有抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、降血脂等多種生理活性，對硫酸酯化多糖的生物活性的研究可為探索卵粘蛋白多種生物活性指明方向。目前已有的關于卵粘蛋白糖鏈在生物活性中的作用的報道并不多，因此，糖鏈對卵粘蛋白生物活性的影響仍將會是今后研究的一大熱點。

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