大孔樹脂純化榛子殼棕色素粗提液的研究

姚麗敏，曠 慧，張 龍，常 晨，龍 雪，王金玲，王 萍，趙 鑫

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

榛子是著名的四大堅(jiān)果之一。在我國東北、華北、西南橫斷山及西北、內(nèi)蒙古均有大量野生榛林分布。近幾年，人工栽培面積不斷擴(kuò)大，僅遼寧省鐵嶺市2008年就栽植人工榛林70多萬畝。目前東北地區(qū)榛子的年產(chǎn)量1億公斤左右，其中大于80%的榛子作為輔料被廣泛用于巧克力、焙烤等食品行業(yè)。其加工、食用后的廢棄物——榛子殼除少部分作為制造活性炭的原料以外[1-2]，并沒有得到充分的利用[3]。榛子殼中富含類黃酮棕色素[4]，具有抗衰老、降脂、美容、養(yǎng)顏等重要的生理活性功能[5-8]，備受食品、藥品、化妝品等行業(yè)青睞，是國內(nèi)外公認(rèn)作為替代合成色素的資源。近年來，對(duì)榛子殼棕色素的提取、穩(wěn)定性及抗氧化性的研究已有報(bào)道[9-11]，但對(duì)于榛子殼棕色素的純化工藝方面研究較少。

本文旨在通過研究大孔樹脂對(duì)榛子殼棕色素的純化，篩選出最佳樹脂及得出最佳純化工藝，為榛子殼棕色素開發(fā)生產(chǎn)提供了一定的參考，為不斷壯大的榛子加工業(yè)提供棕色素純化工藝和新的發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榛子 購自伊春市五營林業(yè)局；手工去仁 榛子殼烘干粉碎，備用；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸 均為國產(chǎn)分析純；大孔樹脂：D101、D4020、AB-8、X-5、NKA-9 購自哈爾濱盛達(dá)生化儀器公司。

ALC-1104分析天平 北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司；恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-1200紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FWl00萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；DFC-6053真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 榛子殼棕色素粗提液的制備 參照文獻(xiàn)[12]制得榛子殼棕色素粗提液。

1.2.2 色素吸收波長的確定 根據(jù)分光光度法，將色素的粗提液在200～500nm區(qū)間進(jìn)行掃描，確定色素吸收波長。

1.2.3 最佳樹脂的篩選

1.2.3.1 靜態(tài)吸附效果比較 分別稱取2g預(yù)處理[13]后的D101（非極性）、D4020（非極性）、X-5（弱極性）、AB-8（弱極性）、NKA-9（極性）樹脂于250mL錐形瓶中，加入5mL色素粗提液。每隔30min測(cè)定其上層溶液的吸光值，繪制不同型號(hào)樹脂對(duì)榛子殼棕色素的吸附曲線。

1.2.3.2 靜態(tài)解吸效果比較 分別稱取2g預(yù)處理后的D101、D4020、AB-8、X-5、NKA-9樹脂于250mL錐形瓶中，加入5mL色素粗提液，振蕩使其充分吸附。吸附飽和后，棄去上層溶液，加入5mL 70%乙醇[14]溶液，每隔30min測(cè)定其上層溶液的吸光值，繪制不同型號(hào)樹脂對(duì)榛子殼棕色素的解吸曲線。

1.2.4 D101樹脂靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 樣液pH對(duì)吸附效果的影響 稱取7份質(zhì)量為2.0g的樹脂于250mL錐形瓶中，分別添加pH=2、3、4、5、6、7、8的榛子殼棕色素粗提液5mL，每隔30min測(cè)定其上層溶液的吸光值，繪制D101對(duì)不同pH的榛子殼棕色素粗提液的吸附曲線，計(jì)算其吸附率[15-16]，公式如下：

吸附率（%）=[A0（吸附前）-A（吸附后）]/A0（吸附前）×100

1.2.4.2 樣液稀釋倍數(shù)對(duì)吸附效果的影響 稱取6份質(zhì)量為2.0g的樹脂于250mL錐形瓶中，分別添加稀釋倍數(shù)為5、10、15、20、25、30倍的榛子殼棕色素粗提液5mL（原樣液濃度為750mg/mL），每隔20min測(cè)定其上層溶液的吸光值，繪制D101對(duì)不同稀釋倍數(shù)的樣液的吸附曲線并計(jì)算其吸附率。

1.2.4.3 乙醇濃度對(duì)解吸效果的影響 稱取5份質(zhì)量為2.0g的樹脂于250mL錐形瓶中，加入5mL濃度為30mg/mL的樣液，待其吸附飽和后，棄去上層溶液；分別加入5mL濃度為50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，將其放入搖床中振蕩24h，使其充分解吸，測(cè)定其吸光值，比較其解吸效果。

1.2.5 D101樹脂動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 上樣流速對(duì)吸附效果的影響 用充分活化的樹脂裝柱（3cm×50cm）于26cm處，將100mL濃度為30mg/mL榛子殼棕色素粗提液分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min的流速上樣。收集流出液，每管5mL，直至流出液吸光值為上柱液的10%（泄漏點(diǎn)）[17-18]，即認(rèn)為樹脂吸附飽和，繪制樹脂在不同上樣流速下對(duì)榛子殼棕色素粗提液的吸附曲線。

1.2.5.2 上樣體積對(duì)吸附效果的影響 用充分活化的樹脂裝柱（3cm×50cm）于26cm處，以2mL/min分別加入70、90、110、130、150mL濃度為30mg/mL色素粗提液，小管收集流出液，每管5mL，直至流出液吸光值為上柱液的10%（泄漏點(diǎn)），即認(rèn)為樹脂吸附飽和，繪制樹脂對(duì)色素的吸附曲線。

1.2.5.3 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響 用充分活化的樹脂裝柱（3cm×50cm）于26cm處，將110mL濃度為30mg/mL的樣液以2mL/min的流速上樣。待樹脂吸附飽和后，用70%的乙醇溶液分別以流速1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min進(jìn)行解吸，繪制解吸曲線。

1.2.6 色價(jià)的測(cè)定 將純化前后的色素濃縮液分別于50℃[19]烘箱中干燥，得到粉末狀的榛子殼棕色素。測(cè)定色素的色價(jià)，公式如下[20]：

式中，A為吸光度；W為100mL被測(cè)溶液中所含樣品的質(zhì)量（g）；R為100mL溶液稀釋至上機(jī)測(cè)試的稀釋倍數(shù)表示樣品濃度為1%，1cm比色皿測(cè)得的色價(jià)值。

1.2.7 洗脫率的計(jì)算 洗脫率計(jì)算公式如下[21]：洗脫率（%）=C×V（/C0×V0）×100。

式中，C和V分別為洗脫液中榛子殼棕色素的質(zhì)量濃度（mg/mL）和體積（mL）；C0和V0分別為吸附前溶液中榛子殼棕色素的質(zhì)量濃度（mg/mL）和體積（mL）。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示，數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛子殼棕色素吸收波長的測(cè)定

波長掃描曲線如圖1所示。

圖1 光譜掃描曲線Fig.1 The curve of spectral scanning

在200～500nm的波長范圍內(nèi)對(duì)提取液進(jìn)行掃描，在235nm處有最大吸收，因此本實(shí)驗(yàn)選擇235nm為測(cè)定波長。

2.2 最佳樹脂的篩選

2.2.1 不同型號(hào)樹脂對(duì)榛子殼棕色素的靜態(tài)吸附 考察不同型號(hào)樹脂在不同時(shí)間段對(duì)榛子殼棕色素的靜態(tài)吸附的影響，其結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在120min時(shí)，D4020對(duì)榛子殼棕色素的吸附趨于飽和，在200min時(shí)，樹脂AB-8和X-5對(duì)榛子殼棕色素的吸附趨于飽和，在240min時(shí)，樹脂NKA-9及D101對(duì)榛子殼棕色素的吸附趨于飽和。在200min之后，上清液的吸光值大小順序?yàn)椋篨-5＞NKA-9＞D4020＞D101＞AB-8，由此可見，AB-8大孔樹脂對(duì)榛子殼棕色素的吸附效果最好，D101次之。

圖2 5種不同大孔樹脂的吸附曲線Fig.2 Absorption curves of five different macro-porous resins

2.2.2 不同型號(hào)樹脂對(duì)榛子殼棕色素的靜態(tài)解吸 考察不同型號(hào)樹脂在不同時(shí)間段對(duì)榛子殼棕色素的靜態(tài)解吸的影響，其結(jié)果見圖3。

圖3 5種不同大孔樹脂的解吸曲線Fig.3 Desorption curves of five different macro-porous resins

由圖3可知，在160min以后，不同型號(hào)樹脂對(duì)榛子殼棕色素的解吸達(dá)到平衡，而上清液的吸光值的大小順序?yàn)椋篋4020＞D101＞X-5＞AB-8＞NKA-9。

結(jié)合圖2和圖3可知，雖然AB-8對(duì)榛子殼棕色素的吸附效果最好，但由于其與榛子殼棕色素結(jié)合過于緊密，使其解吸比較困難。因此，綜合考慮不同型號(hào)樹脂對(duì)榛子殼棕色素吸附和解吸的影響，樹脂D101為分離純化榛子殼棕色素的最佳樹脂。

2.3 D101樹脂靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 樣液pH對(duì)吸附效果的影響 樣液pH對(duì)吸附效果的影響如圖4和表1所示。

圖4 樣液pH對(duì)靜態(tài)吸附的影響Fig.4 The effect of different pH of sample solution on static absorption

由圖4可知，在吸附了20min之后，榛子殼棕色素溶液的吸光值都有了較大程度的下降，在200min時(shí)基本達(dá)到吸附飽和。

表1 樣液pH對(duì)樹脂靜態(tài)吸附的影響Table 1 The effect of different pH of sample solution on static absorption

由表1可知，隨著pH的增大，色素吸附率逐漸增大，pH=4時(shí)色素吸附率達(dá)到最大，并且顏色也最佳，在pH＜4時(shí)，榛子殼棕色素溶液的顏色變淺，這是由于氫離子濃度的不同對(duì)發(fā)色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響[22]。之后隨著pH增大色素吸附率降低很快，pH=5后基本上趨于穩(wěn)定。

2.3.2 樣液稀釋倍數(shù)對(duì)吸附效果的影響 樣液稀釋倍數(shù)對(duì)吸附效果的影響如圖5和表2所示。

圖5 不同稀釋倍數(shù)對(duì)吸附的影響Fig.5 The effect of different dilution of sample solution on absorption

由圖5所示，在80min之后D101樹脂對(duì)各濃度的溶液基本上都吸附飽和，所以樣液的稀釋倍數(shù)對(duì)吸附飽和的時(shí)間基本上沒有太大的影響。

由表2可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，即隨著樣液濃度的降低，吸附率逐漸增大，在稀釋到25倍時(shí)，吸附率達(dá)到最大，即達(dá)到80.1%。之后隨著稀釋倍數(shù)的增加，吸附率又逐漸下降，因此樣液應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)稀釋后應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。上官新晨等[23]利用大孔樹脂對(duì)紫紅薯色素吸附和解吸的特性研究中也給了同樣的結(jié)論，即適當(dāng)?shù)慕档蜆右簼舛?，更有利于吸附，也有?bào)道認(rèn)為樣液濃度越大越有利于吸附[24-25]，還有報(bào)道認(rèn)為樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能影響不大[26]，這可能是各實(shí)驗(yàn)所選樣液濃度范圍差異和色素性質(zhì)差異所致。在本實(shí)驗(yàn)中25倍為最佳稀釋倍數(shù)，即最佳上樣濃度為30mg/mL。

表2 不同稀釋倍數(shù)對(duì)靜態(tài)吸附的影響Table 2 The effect of different dilution of sample solution on absorption

2.3.3 乙醇濃度對(duì)解吸效果的影響 乙醇濃度對(duì)解吸效果的影響如表3所示。

表3 不同濃度的乙醇解吸液的吸光值Table 3 Absorbency of different alcohol desorption concentration

由表3可知，隨著乙醇濃度的增加，解吸效果逐漸變好，在乙醇濃度達(dá)到70%后，解吸液吸光值趨于穩(wěn)定，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得乙醇濃度為70%是最佳的選擇，既可以將色素很好地解吸出來，又避免了乙醇的浪費(fèi)。

2.4 D101樹脂動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 上樣流速對(duì)吸附效果的影響 上樣流速對(duì)吸附效果的影響如圖6所示。

圖6 不同上樣流速對(duì)吸附的影響Fig.6 The effect of different velocity of flow on absorption

由圖6可知，色素溶液上樣的流速對(duì)吸附能力的影響比較大，大孔樹脂柱層析是一種動(dòng)態(tài)吸附過程，色素溶液上樣流速的變化直接影響色素在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散，從而影響吸附效果。流速過快，溶質(zhì)分子還來不及擴(kuò)散到樹脂內(nèi)表面，就會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象，如當(dāng)上樣流速為3.0mL/min時(shí)，當(dāng)管號(hào)為21時(shí)就已經(jīng)到達(dá)泄露點(diǎn)，色素溶液與樹脂接觸時(shí)間短，這不利于樹脂很好地吸附色素，吸附效率大大下降，也造成了物料的浪費(fèi)；流速過慢，操作時(shí)間長，也降低了工作效率。因此，樣液上樣流速控制在1.5～2.0mL/min效果最佳。

2.4.2 上樣體積對(duì)吸附效果的影響 上樣體積對(duì)吸附效果的影響如圖7所示。

圖7 上樣體積對(duì)吸附效果的影響Fig.7 The effect of sample volume on absorption

由圖7可知，上樣體積為70mL時(shí)，樹脂沒有吸附飽和，降低了純化效率；而當(dāng)上樣體積為130mL和150mL時(shí)，泄露點(diǎn)過早到達(dá)，造成資源浪費(fèi)；當(dāng)上樣體積為90mL和110mL時(shí)，達(dá)到泄露點(diǎn)的時(shí)間相近，考慮到純化效率，本實(shí)驗(yàn)最佳的上樣體積為110mL。

2.4.3 洗脫流速對(duì)解吸效果影響 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響如圖8所示。

圖8 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響Fig.8 The effect of velocity of flow on desorption

由圖8可知，隨著洗脫的進(jìn)行，流出液中榛子殼棕色素的濃度升高到最大以后，又迅速降低，此時(shí)已收集到大部分色素，當(dāng)流出液為無色時(shí)，說明洗脫已完成。當(dāng)洗脫流速過大時(shí)，如2.5～3.0mL/min，對(duì)洗脫出的色素溶液富集效果較差，而且流速為1.0、2.5、3.0mL/min時(shí)基線吸收較高，也不利于富集，同時(shí)有一定的拖尾現(xiàn)象。當(dāng)洗脫流速為1.0mL/min時(shí)，工作效率過低，而當(dāng)洗脫流速為1.5～2.0mL/min時(shí)，不僅對(duì)榛子殼棕色素有富集效果，也無拖尾現(xiàn)象，因此，洗脫流速為1.5～2.0mL/min時(shí)，洗脫效果最佳。

2.5 榛子殼棕色素純化前后的色價(jià)比較

榛子殼中棕色素的含量較為豐富，用上述實(shí)驗(yàn)所確定的最佳純化條件對(duì)榛子殼棕色素進(jìn)行分離純化，進(jìn)行純化前后光譜掃描，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，純化后的色素溶液在240～300nm的范圍內(nèi)吸收大大降低，可見除去了一部分雜質(zhì)。對(duì)比純化前后光譜掃描曲線可知，純化后的榛子殼棕色素的純度有了一定程度的提高。根據(jù)公式=A×R/W計(jì)算可知，色價(jià)由22.3提高到了46.8，洗脫率為83.4%。

圖9 光譜掃描曲線Fig.9 The curve of spectral scanning

3 結(jié)論

在所選的5種樹脂中，D101對(duì)榛子殼棕色素有較好的吸附和解吸能力，適用于榛子殼棕色素的分離純化。結(jié)合D101靜態(tài)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D101樹脂分離純化榛子殼棕色素的最佳條件為：樣液pH=4.0，上樣濃度為30mg/mL，上樣體積為110mL，上樣流速為1.5～2.0mL/min；洗脫劑為70%的乙醇，洗脫流速為1.5～2.0mL/min為最佳純化條件。經(jīng)D101純化的色素，色價(jià)從22.3提高到了46.8，洗脫率可達(dá)83.4%。

作為食品著色劑，榛子殼棕色素可廣泛用于飲料、果凍、冰淇淋等加工工業(yè)中；還可用于化妝品，染料等工業(yè)。作為一種新興的天然食品著色劑，榛子殼棕色素必定會(huì)有很好的發(fā)展前景。

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