甲基吡喃花色苷的制備優(yōu)化及H P L C-MS/MS分析

鄺敏杰，吳 鬧，齊敏玉，何靜仁，2，*，李書藝，鄧 莉，2，陳 軒，2

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點實驗室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)糧油食品質(zhì)量檢驗測試中心，湖北武漢 430023）

花色苷（anthocyanins）是一類廣泛存在于果蔬類植物中的水溶性天然色素，屬類黃酮多酚化合物，具有重要生物活性和生理功能[1-3]。大部分天然花色苷由于其本身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性而極大限制其在產(chǎn)品加工和貯藏過程中的直接應(yīng)用[4]?；ㄉ昭苌铮ˋnthocyanin derivatives）是近些年發(fā)現(xiàn)于花色苷果蔬的加工產(chǎn)品如葡萄酒和飲料或某些特殊類的植物中[4-5]，由花色苷在發(fā)酵和陳釀過程中經(jīng)一系列生物和化學(xué)反應(yīng)形成的，或在植物體內(nèi)經(jīng)生物代謝形成的一系列較穩(wěn)定的花色苷天然衍生物。因此，花色苷衍生物家族的形成及其在食品加工中的重要性已越來越引起科研人員的興趣和重視。

甲基吡喃花色苷（methyl-pyranoanthocyanins）是花色苷衍生物家族的一種。它的基本結(jié)構(gòu)是在原花色苷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在花色苷的C4位與C5位的羥基之間經(jīng)環(huán)加合反應(yīng)形成另外的第四個吡喃環(huán)D[5-6]（結(jié)構(gòu)如圖1）。目前，國內(nèi)外對甲基吡喃花色苷的研究較少，2000年Lu等在黑醋栗種子的70%丙酮提取液中發(fā)現(xiàn)了甲基吡喃花色苷[7]。2006年He等在陳釀葡萄酒中發(fā)現(xiàn)甲基吡喃花色苷，并經(jīng)質(zhì)譜和核磁鑒定首次證實了葡萄花色苷與乙酰乙酸反應(yīng)形成甲基吡喃花色苷[8]的機制。本文擬采用葡萄皮紅色素提取物（含大量錦葵花色苷malvidin-3-glucoside）在丙酮介質(zhì)中反應(yīng)合成甲基吡喃花色苷的技術(shù)路線，正交實驗優(yōu)化反應(yīng)條件以methyl-pyranoMv的生成量為指標，高效液相色譜監(jiān)測反應(yīng)過程，高效液相色譜-二極管陣列檢測-串聯(lián)離子阱多級質(zhì)譜法（HPLC-PDA-MS/MS）對其結(jié)構(gòu)進行分析和確認，為甲基吡喃花色苷的高效制備、花色苷的分子修飾及理化性質(zhì)和功能特性評價的深入研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

葡萄皮紅色素提取物（色價30） 購于云南通海楊氏天然產(chǎn)物有限公司；甲基吡喃錦葵花色苷標準品（純度≥99%） 波爾圖大學(xué)（University of Porto）化學(xué)學(xué)院；聚酰胺樹脂（60-100目） 上海摩速科學(xué)器材有限公司；乙腈、甲酸、甲醇等 均為高效液相色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙醇、丙酮、鹽酸、氫氧化鈉等 均為分析純，天津市永太化學(xué)試劑有限公司。

LTQ-XL超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司；SSI Series1500高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器） SSI公司；Lambda 25紫外/可見分光光度計 北京譜朋科技有限公司；電子天平 梅特勒-托利多AL204；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Buchi R-3；冷凍干燥機 CHRIST ALPHA 2-4；超純水機 成都品成科技有限公司；水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)機制 葡萄皮花色苷與丙酮在一定溫度和pH條件下反應(yīng)生成甲基吡喃花色苷，反應(yīng)機制見圖1。丙酮在一定的弱酸性pH條件下，β位碳先與α位碳發(fā)生烯醇化，隨后具有不同電荷特性的α位和β位碳與花色苷的C4位及C5位的羥基之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，經(jīng)脫水，氧化和脫羧，生成具有另外一個吡喃環(huán)的花色苷氧鎓離子[8]。

1.2.2 葡萄皮紅色素提取物中總花色苷的測定 采用pH示差法測定[9-11]花色苷含量。

圖1 甲基吡喃花色苷的形成機制Fig.1 The proposed formation mechanism of methyl pyranoanthocyanins

其中：A—在pH為1.0和pH為4.5處吸光度的差值；MW—cy-3-glu（矢車菊-3-葡萄糖苷）的相對分子質(zhì)量（449.4）；DF—稀釋倍數(shù)；ε—cy-3-glu的消光系數(shù)（26900）；l—比色皿光程1cm。

根據(jù)pH示差法測得的葡萄皮紅色素提取物中總花色苷的含量為102.99mg/g。

1.2.3 反應(yīng)產(chǎn)物中甲基吡喃花色苷含量及得率計算

利用高效液相色譜測定反應(yīng)產(chǎn)物中甲基吡喃花色苷的含量。

式中，X—樣品中甲基吡喃的濃度（mg/mL）；S1—樣品峰面積；C—甲基吡喃花色苷標準品的濃度（mg/mL）；S2—甲基吡喃花色苷標準品的峰面積

甲基吡喃花色苷得率（%）=實際生成量（mg）/理論生成量（mg）×100[12]

1.2.4 甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的實驗設(shè)計 選擇反應(yīng)時間、葡萄皮紅色素提取物濃度、反應(yīng)溶液pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)物比例進行單因素實驗，考察不同條件對甲基吡喃花色苷合成效果的影響，以甲基吡喃花色苷得率為考察指標。

1.2.4.1 反應(yīng)時間單因素實驗 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，溫度45℃，pH為3.2，考察反應(yīng)時間為6、7、8、9、10d時對甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.2 葡萄皮紅色素提取物濃度單因素實驗 葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，溫度45℃，pH為3.2，考察葡萄皮紅色素提取物濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL時對甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.3 pH單因素實驗 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，溫度45℃，考察不同pH（2.6、2.8、3.0、3.2、3.6）對甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.4 溫度單因素實驗 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，pH3.2，考察不同溫度（30、35、40、45、50℃）對甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.5 反應(yīng)物比例單因素實驗 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，溫度45℃，pH為3.2，考察葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1時甲基吡喃花色苷的合成效果。

正交實驗：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平，按L9（34）正交表排列進行正交實驗，因素水平表設(shè)計如表1所示，每組設(shè)定3個重復(fù)組，優(yōu)化葡萄皮紅色素提取物與丙酮反應(yīng)合成甲基吡喃花色苷的參數(shù)。

表1 正交設(shè)計因素水平表Table 1 Levels and factors table of orthogonal experiment

1.2.5 甲基吡喃花色苷的光譜特征 配制一定濃度的甲基吡喃花色苷水溶液，在300～700nm波長范圍內(nèi)進行紫外可見全掃描，從而得出甲基吡喃花色苷色素的最大吸收波長。

1.2.6 甲基吡喃花色苷高效液相色譜分析[8]取產(chǎn)物溶液用SSI Series1500高效液相色譜檢測，色譜參考條件：LiChrospher RP-C18柱，250mm×4.6mm，5μm色譜柱。二極管陣列檢測器。流動相：A為甲酸∶水（1∶9，v/v），B為乙腈∶甲酸∶水（8∶1∶1，v/v/v）。檢測波長：478nm。進樣量：20μL。流速：1mL/min。洗脫梯度：0～70min，B從15%線性增加到35%，70～75min，B增加到80%，之后沖洗系統(tǒng)10min。

1.2.7 甲基吡喃花色苷高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析花色苷與丙酮反應(yīng)液經(jīng)聚酰胺樹脂純化（?30×600mm，洗脫流速為1倍柱體積/小時），取10%酸化乙醇洗脫液洗脫出來的溶液進行HPLC-MS測定。

HPLC參數(shù)：色譜柱：賽默反相C18色譜柱，100mm×2.1mm內(nèi)徑，1.9μm粒徑；檢測器：DAD檢測器；柱溫：25℃；流速：0.2mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：478nm。流動相A：0.3%甲酸水溶液；流動相B：甲酸-乙腈-水（0.3∶80∶19.7）；洗脫梯度：0min，10%B；30min，20%B；35min，，100%B；45min，10%B。

MS設(shè)定的參數(shù)如下：ESI離子源；毛細管溫度為350℃；毛細管電壓為47V；N2：流速為30L/min，離子掃描范圍為100～1500（m/z），目標離子531（m/z）。采用正離子掃描模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響甲基吡喃花色苷產(chǎn)物得率的單因素分析

2.1.1 反應(yīng)時間對甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響在葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，溫度45℃，pH為3.2，提取物與丙酮的比例為20∶1條件下，反應(yīng)時間對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著反應(yīng)時間的增加，甲基吡喃花色苷的生成量也逐漸增加，第9d時甲基吡喃花色苷生成量達最大值，隨后甲基吡喃花色苷含量開始略微下降，可能是由于反應(yīng)物花色苷或生成物甲基吡喃花色苷在45℃下隨時間降解的原因。因此，最佳反應(yīng)時間為9d。

圖2 反應(yīng)時間對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.2 葡萄皮紅色素提取物濃度對甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 花色苷反應(yīng)物濃度是影響合成反應(yīng)的關(guān)鍵因素，花色苷反應(yīng)物濃度對甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率有顯著影響。不同濃度葡萄皮紅色素提取物對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖3所示。當提取物濃度由1mg/mL增加到2.5mg/mL時，隨著濃度的增加甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率也逐漸增加。當濃度繼續(xù)增大時，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率無增加趨勢甚至略微下降，故最適宜葡萄皮紅色素提取物濃度在2.5mg/mL左右。

圖3 葡萄皮紅色素提取物濃度對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of concentration of extracts of red grape skins on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.3 pH對甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 反應(yīng)體系的pH對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，pH對甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響非常顯著，當pH由2.6增大到3.0左右時，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率先緩慢減小然后迅速增加，到3.0時達到最高點。隨著pH的繼續(xù)增大甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率隨之減小，當pH大于3.6時，反應(yīng)幾乎不能進行，產(chǎn)率接近于零。在溶液介質(zhì)中，花色苷隨pH的變化而發(fā)生結(jié)構(gòu)上的轉(zhuǎn)變[13]，這種轉(zhuǎn)變影響烯醇化的丙酮與花色苷的C4位及C5位的羥基之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)。由此可知，制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)體系pH在3.0左右。

圖4 pH對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.4 溫度對甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 溫度與甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率有密切關(guān)系，不同溫度對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響見圖5。由圖5可知，反應(yīng)溫度從30℃升高到35℃時甲基吡喃花色苷產(chǎn)率呈直線上升，隨后，隨著溫度的升高產(chǎn)率緩慢增加，45℃時到達最大。溫度繼續(xù)上升時產(chǎn)率降低，可能是由于溫度過高引起花色苷的部分降解。因此選取溫度45℃為反應(yīng)的最佳溫度。

圖5 溫度對甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of methyl pyranoanthocyanins

圖6 反應(yīng)物比例對甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率影響Fig.6 Effect of material-to-lipid ratio on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.5 反應(yīng)物比例對甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 不同反應(yīng)物比例（葡萄皮紅色素提取物mg∶丙酮mL）對甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖6所示。當反應(yīng)物比例由10∶1增加到20∶1時，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率逐漸增加，繼續(xù)增加反應(yīng)物的比例時，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率呈下降趨勢。由此可知，制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)物比例為20∶1。

2.2 正交實驗結(jié)果

表2 正交實驗安排及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment arrangement and results

正交實驗結(jié)果如表2所示，以甲基吡喃花色苷的得率為指標，由直觀分析法知：各因素從主到次的順序為：（D）pH、（B）葡萄皮紅色素提取物濃度、（A）反應(yīng)物比例、（C）溫度，最優(yōu)方案為：A1B2C2D2，即反應(yīng)物比例為15∶1，底物濃度為2.5mg/mL，溫度為45℃，pH為3.0。由理論分析得到的優(yōu)化方案和正交表中的結(jié)果是一致的。在該反應(yīng)條件下甲基吡喃花色苷的得率為49.4%，高于表2中其他組實驗結(jié)果。因此，A1B2C2D2為制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)條件。

2.3 甲基吡喃花色苷的光譜特征

圖7 甲基吡喃花色苷色素的特征吸收光譜Fig.7 Visible absorption spectrum of the methyl-pyranoMv

甲基吡喃花色苷的紫外可見光譜如圖7所示，由圖7可知，甲基吡喃花色苷在478nm左右有一強吸收峰，與原花色苷最大吸收峰（524nm左右）相比，甲基吡喃花色苷的最大吸收波長明顯發(fā)生了藍移，呈現(xiàn)黃色色澤。

2.4 反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜分析

圖8 花色苷反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜圖（530和478nm）Fig.8 HPLC chromatograms recorded at 530 and 478 nm of the reaction mixture of the anthocyanin-acetone adducts

圖8為高效液相色譜分析葡萄皮紅花色苷反應(yīng)生成甲基吡喃花色苷的色譜圖。由圖8可知，當檢測波長從530nm（花色苷的特征吸收波長）變?yōu)?78nm時，保留時間23min處出現(xiàn)一新色譜峰A（如圖8峰A），結(jié)合其特征吸收光譜的掃描結(jié)果，初步判定峰A物質(zhì)為錦葵花色苷反應(yīng)形成的甲基吡喃花色苷。色譜圖還表明，在表2色譜分離條件下花色苷和甲基吡喃花色苷30min內(nèi)達到顯著的分離效果。

2.5 反應(yīng)主要產(chǎn)物高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果

高效液相色譜-二極管陣列檢測-串聯(lián)離子阱多級質(zhì)譜對初步純化后的反應(yīng)產(chǎn)物進行分析，其總離子流色譜圖（a）和主要目標化合物的一級（b）、二級（c）質(zhì)譜圖如圖9所示。

由圖9可知，峰1的保留時間為32.26min，其最大吸收波長為478nm，分子離子m/z為531，二級質(zhì)譜顯示分子離子m/z 531有一碎片離子m/z 369，它是失去一分子葡萄糖[M-162]+獲得，此結(jié)果與He等[8]的結(jié)果一致。Hayasaka等[14]曾對分子離子m/z 531的三級質(zhì)譜進行分析，根據(jù)失去的原子質(zhì)量分別為16、32、44、61、89amu可得出分子離子m/z 531的物質(zhì)為錦葵花色苷衍生物。Jingren he等[8]于2006年利用HPLC-MS及NMR等技術(shù)手段證實了錦葵花色苷與乙酰乙酸反應(yīng)生成的錦葵花色苷衍生物的結(jié)構(gòu)，即為甲基吡喃花色苷。綜上所述，根據(jù)特征吸收光譜表征和多級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析，確認峰1物質(zhì)為錦葵花色苷與丙酮反應(yīng)生成的甲基吡喃花色苷。

3 結(jié)論

采用正交實驗法優(yōu)化了制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)條件，影響產(chǎn)物得率的主要因素依次是pH、葡萄皮紅色素提取物濃度、反應(yīng)物比例、反應(yīng)溫度?；ㄉ赵诒橘|(zhì)中反應(yīng)合成甲基吡喃花色苷的最佳條件為：反應(yīng)物比例（葡萄紅色素提取物mg∶丙酮mL）為15∶1，葡萄皮紅色素提取物濃度2.5mg/mL，反應(yīng)溫度45℃，體系pH為3.0，在該條件下，甲基吡喃花色苷產(chǎn)物得率為49.4%。利用高效液相色譜串聯(lián)離子阱多級質(zhì)譜結(jié)合特征吸收光譜分析鑒定了反應(yīng)主要產(chǎn)物為甲基吡喃錦葵花色苷。

圖9 花色苷與丙酮反應(yīng)生成物的HPLC-MS圖譜（a）、峰1的一級（b）和二級（c）質(zhì)譜圖Fig.9 HPLC-MS chromatograms（a）of the anthocyanin-acetone adducts and MS1（b）and MS2（c）fragmentation scheme for peak 1

[1]Di Majo D，La Guardia M，Giammanco S，et al.The antioxidant capacity of red wine in relationship with its polyphenolic constituents[J].Food Chemistry，2008，111（1）：45-49.

[2]于斌，余小平，易龍，等.黑米花色苷抑制人乳腺癌細胞促血管生成因子表達的機制[J].營養(yǎng)學(xué)報，2010（6）：545-550.

[3]蔡花真，王霞.紫甘薯花色苷組分抑制小鼠肝、腎、心、脾脂質(zhì)過氧化的研究[J].食品工業(yè)，2009（4）：6-8.

[4]何靜仁，鄺敏杰，鄧莉，等.膳食花色苷衍生物家族的結(jié)構(gòu)及其形成機制[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（2）：343-355.

[5]De Freitas V，Mateus N.Formation of pyranoanthocyanins in red wines：A new and diverse class of anthocyanin derivatives[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011，401（5）：1463-1473.

[6]Rentzsch M，Schwarz M，Winterhalter P.Pyranoanthocyanins-An overview on structures，occurrence，and pathways of formation[J].Trends in Food Science&Technology，2007，18（10）：526-534.

[7]Lu Y，Sun Y，F(xiàn)oo L Y.Novel pyranoanthocyanins from black currant seed[J].Tetrahedron Letters，2000，41（31）：5975-5978.

[8]He J，Santos-Buelga C，Silva A M S，et al.Isolation and structural characterization of new anthocyanin-derived yellow pigments in aged red wines[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（25）：9598-9603.

[9]Giusti M，Wrolstad R E.Characterization and measurement of anthocyanins by UV-Visible spectroscopy[J].Current Protocols in Food Analytical Chemistry，2001（8）：1-13.

[10]Wrolstad R E，Durst R W，Lee J.Tracking color and pigment changes in anthocyanin products[J].Trends in Food Science&Technology，2005，16（9）：423-428.

[11]李洋，張媛，李琳，等.蛇莓果實總花色苷含量測定方法的比較[J].化學(xué)研究，2011，22（5）：95-98.

[12]劉傳菊，戚向陽，任獻忠，等.楊梅花色苷的提取分離研究[J].中國食品學(xué)報，2009，9（1）：59-64.

[13]孫建霞，張燕，胡小松，等.花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與降解機制研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（3）：996-1008.

[14]Hayasaka Y，Asenstorfer R E.Screening for potential pigments derived from anthocyanins in red wine using nanoelectrospray tandem mass spectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（4）：756-761.