ST－1菌株對致病疫霉抑制作用的初步研究*

吳艷清，張 映，王 穎

(保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000)

致病疫霉是鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉目卵菌，生理分化明顯，可引起番茄和馬鈴薯的晚疫病，是嚴(yán)重危害農(nóng)作物生長的重要植物病原微生物［1］。目前在生產(chǎn)中除利用有限的抗病品種外，主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥來防治晚疫病，但化學(xué)農(nóng)藥的長期使用已導(dǎo)致致病疫霉抗藥性逐漸增強(qiáng)、環(huán)境污染日益嚴(yán)重。而利用拮抗微生物控制該病具有無污染、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點，使許多學(xué)者對拮抗微生物的研究有更多的注意。

放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)的原核生物。放線菌廣泛地分布在含水量較低、有機(jī)物較豐富和呈微堿性的土壤中。已有研究表明放線菌能夠生產(chǎn)出許多重要的活性物質(zhì)，已經(jīng)從放線菌的次生代謝產(chǎn)物中篩選出許多新的生化藥物［2］，從土壤中篩選出對致病疫霉抑制作用明顯的放線菌是研究的一大方向。

研究表明，有些學(xué)者已經(jīng)篩選出一些對致病疫霉菌絲生長和孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用的拮抗真菌、放線菌和細(xì)菌［4］。本實驗從土壤中分離純化出拮抗致病疫霉的放線菌，并研究其發(fā)酵液對致病疫霉的抑制作用。為今后開發(fā)田間有效控制馬鈴薯晚疫病的高效、穩(wěn)定的生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)，對馬鈴薯晚疫病的有效控制也具有重要的指導(dǎo)意義和參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 使用儀器

JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司);SW－CJ－2F凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);BXW－30R立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LRH－250G光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);LRH－250A生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);電熱鼓風(fēng)干燥器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);IS－RDD3恒溫振蕩器(泰山市鑫達(dá)氣彈簧有限公司)

1.1.2 試劑

試劑:黑麥、可溶性淀粉、75%酒精、蔗糖、瓊脂、無菌水、KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4。

1.2 實驗材料

1.2.1 供試材料

試驗采用ST－1菌株從土壤中篩選，致病疫霉由河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病理研究室惠贈。

1.2.2 供試培養(yǎng)基配方

本實驗用到了三種培養(yǎng)基:

高氏 I號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂 20g，水1000mL，pH7.2 －7.4。

高氏 I號液體培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)e-SO40.01g，水 1000mL，pH7.2 －7.4。

黑麥培養(yǎng)基:黑麥65g，瓊脂16g，蔗糖20g，水1000mL。

1.3 方法步驟

1.3.1 放線菌ST－1的分離純化

從石家莊深澤縣采集土樣，自然風(fēng)干后稱取10g土樣放入盛有90ml無菌水三角瓶中，振蕩20min，用移液管吸取1ml加入盛有9ml無菌水的試管中制成10－1土壤稀釋液，以此類推制成 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6幾個梯度的土壤懸浮液。利用稀釋涂布平板法涂布在高氏I號培養(yǎng)基上對放線菌進(jìn)行分離純化，將分離純化的放線菌在28℃光照培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)5－7天，利用顯微鏡觀察菌落的形態(tài)、色澤、有無氣生菌絲、色素產(chǎn)生情況等初步鑒定為放線菌［1－3］，并對分離出的一株放線菌編號為ST－1。在高氏I號培養(yǎng)基上對ST－1菌株進(jìn)行純化，將純化的ST－1菌株放在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ST－1菌株對致病疫霉抑制作用測定

進(jìn)一步篩選不同DPPC與甘露醇質(zhì)量比（1∶1、1∶2、1∶3）的白藜蘆醇DPPC脂質(zhì)粉霧劑處方，通過對外觀、流動性和載藥量綜合比較，選擇甘露醇與DPPC質(zhì)量比為2∶1，作為粉霧劑最優(yōu)處方（圖2）。

利用對峙培養(yǎng)法測定。將活化好的致病疫霉用滅菌后的打孔器打取直徑13mm的菌餅并接種于黑麥培養(yǎng)基中央，將活化好的ST－1菌株用滅菌后的打孔器打取直徑9mm的菌餅并接種于致病疫霉菌餅兩側(cè)，使兩個ST－1菌株分別與致病疫霉菌株相距15mm。重復(fù)三次。以空白的致病疫霉菌餅為對照，做三組對照。20℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)6－8天，觀察致病疫霉的生長情況，并計算抑菌率。

圖1:ST－1菌株對致病疫霉抑制效果

抑菌率(%)=(對照菌落半徑－處理菌落半徑)/對照菌落半徑*100

1.3.3 ST－1菌株發(fā)酵液對致病疫霉抑制作用的測定

制備ST－1菌株發(fā)酵液。將ST－1菌株單一菌落放入高氏I號液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)6－8天，用細(xì)菌過濾器過濾得到ST－1菌株發(fā)酵液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用濾紙片法測定ST－1菌株發(fā)酵液對致病疫霉抑制作用。用滅菌后的打孔器在活化的致病疫霉上打孔并接種于黑麥培養(yǎng)基平板中央，在致病疫霉菌餅左右各相距15mm對稱放置1片無菌濾紙片，并滴加20微升ST－1菌株發(fā)酵液，重復(fù)三次，再做三組空白試驗作為對照試驗，20℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察抑菌效果，根據(jù)抑菌結(jié)果計算抑菌率。

1.3.4 處理后的ST－1菌株發(fā)酵液對致病疫霉抑制作用的測定

處理后的ST－1菌株發(fā)酵液的制備。將ST－1菌株單一菌落放入高氏I號液體培養(yǎng)基中，再向其液體培養(yǎng)基中挑入少量致病疫霉菌絲，振蕩培養(yǎng)6－8天，用細(xì)菌過濾器過濾得到處理后的ST－1菌株發(fā)酵液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用濾紙片法測定。用滅菌后的打孔器在活化的致病疫霉上打孔并接種于黑麥培養(yǎng)基平板中央，在致病疫霉菌試驗，20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察抑菌效果，根據(jù)抑菌結(jié)果計算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ST－1菌株對致病疫霉抑制作用的測定結(jié)果

表1:ST－1菌株對致病疫霉抑制作用結(jié)果

2.2 ST－1菌株發(fā)酵液對致病疫霉抑制作用的測定結(jié)果

將ST－1菌株發(fā)酵液與致病疫霉對峙培養(yǎng)8－10天，結(jié)果如圖2所示，ST－1菌株的發(fā)酵液對致病疫霉沒有明顯的抑制作用。

圖2:ST－1菌株發(fā)酵液對致病疫霉的抑制效果

2.3 處理后的ST－1菌株發(fā)酵液對致病疫霉抑制作用的測定結(jié)果

將加有少量致病疫霉菌絲的放線菌菌液過濾得到的發(fā)酵液與致病疫霉對峙培養(yǎng)8－10天后，結(jié)果如圖3、表2所示，處理后的發(fā)酵液對致病疫霉有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到了30.08%。發(fā)酵液的抑菌率明顯小于菌株的抑菌率。

圖3:ST－1菌株被刺激后對致病疫霉的抑制效果(第10天)

表2:ST－1菌株被刺激后對致病疫霉的抑制效果(第10天)

3 結(jié)論

放線菌作為一種開發(fā)微生物藥物潛力最大的微生物資源之一，已從土壤中分離純化出許多拮抗放線菌，如放線菌NB8菌株［5］，其活體對致病疫霉抑制率為 97.33%，發(fā)酵液對致病疫霉抑制率為92.00%，而且其抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性比較強(qiáng)，受環(huán)境的影響比較小，傳代10代后抑菌性質(zhì)還基本保持穩(wěn)定?？梢娹卓狗啪€菌有很大的應(yīng)用潛力。

本研究著重測定放線菌ST－1對病致病疫霉的抑制作用，結(jié)果表明ST－1菌株對致病疫霉有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到了72.14%。而ST－1放線菌發(fā)酵液在與致病疫霉對峙培養(yǎng)過程中，對致病疫霉卻沒有明顯的抑制作用，其原因可能是受到了致病疫霉本身或其代謝產(chǎn)物的刺激，才產(chǎn)生了對致病疫霉菌絲生長有抑制作用的物質(zhì)，進(jìn)而本研究有測定加有少量致病疫霉菌絲的ST－1菌株的發(fā)酵液，結(jié)果表明，其發(fā)酵液對致病疫霉有一定的抑制作用，抑菌率為30.08%，由此可以看出對有致病疫霉抑制作用的抑制物質(zhì)的產(chǎn)生與致病疫霉的刺激有關(guān)系。未受到致病疫霉刺激的ST－1菌株的發(fā)酵液對致病疫霉卻沒有明顯的抑制作用，其原因也可能是放線菌發(fā)酵液的量隨著實驗的進(jìn)行而減少，從而抑制作用不明顯。這些結(jié)果表明ST－1菌株在抑制致病疫霉菌絲生長和有效控制馬鈴薯、番茄的晚疫病具有較大的應(yīng)用潛能，對其抑制物質(zhì)的穩(wěn)定性等有待進(jìn)一步去開展研究。

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