“綠色植物中色素的提取”實(shí)驗(yàn)儀器和技術(shù)的改進(jìn)

曹宏梅+賴紅偉+董順福+韓麗琴+陶然

“綠色植物中色素的提取”是醫(yī)學(xué)院校多個(gè)專業(yè)學(xué)生的必修實(shí)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)儀器、裝柱方法以及洗脫劑的選用四個(gè)方面對(duì)此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，首先解決了實(shí)驗(yàn)材料的受限性，其次節(jié)約了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的經(jīng)費(fèi)，再次簡(jiǎn)化了洗脫的步驟，最后避免了有毒試劑的危害，使得色素的提取實(shí)驗(yàn)取得了較好的效果。

綠色植物色素提取實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)技術(shù)改進(jìn)一、改進(jìn)的背景

有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的“綠色植物中色素的提取”是醫(yī)學(xué)院校臨床醫(yī)學(xué)、食品質(zhì)量與安全、藥學(xué)、藥物制劑學(xué)、臨床藥學(xué)、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、臨床輸血、預(yù)防醫(yī)學(xué)和市場(chǎng)營(yíng)銷等專業(yè)學(xué)生的一個(gè)必修實(shí)驗(yàn)。自2008年至2012年以來(lái)，筆者所在院校對(duì)此實(shí)驗(yàn)用新鮮菠菜葉作為實(shí)驗(yàn)材料，用層析柱作為柱色譜分離的儀器，用干法裝柱，用9：1石油醚-丙酮、7∶3石油醚-丙酮和3∶1∶1正丁醇-乙醇-水分別作洗脫劑。這種實(shí)驗(yàn)方法，不僅色素分離的步驟繁瑣，而且所用的化學(xué)試劑總類多、用量大，存在著諸多弊端，因此很有必要對(duì)此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。

二、改進(jìn)的內(nèi)容

（一）改進(jìn)實(shí)驗(yàn)材料

此實(shí)驗(yàn)用新鮮的菠菜葉作為實(shí)驗(yàn)材料，由于北方菠菜的種植易受季節(jié)的限制，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可用韭菜、香菜、生菜、芹菜和空心菜等四季均可種植的蔬菜來(lái)代替菠菜。改進(jìn)后，解決了此實(shí)驗(yàn)的材料具有局限性的弊端。

（二）改進(jìn)柱色譜分離所用的實(shí)驗(yàn)儀器

改進(jìn)前，柱色譜分離所用的實(shí)驗(yàn)儀器是層析柱。層析柱是一根下部帶有活塞的玻璃管，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其在使用時(shí)存在一定的弊端：首先，身為玻璃儀器存在易被損壞的風(fēng)險(xiǎn)；其次，層析柱價(jià)格貴，每根50元；最后，用層析柱進(jìn)行柱色譜分離，消耗的吸附劑用量較大。

改進(jìn)后，用分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中淘汰下來(lái)的酸式滴定管代替層析柱進(jìn)行柱色譜分離實(shí)驗(yàn)。筆者把分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已破損、可利用的酸式滴定管收集起來(lái)，根據(jù)儀器實(shí)際損壞情況，一方面，可采取用酒精噴燈將酸式滴定管管口破損部位燒熔，進(jìn)行鈍化處理，以避免破損部位傷人，達(dá)到再利用的目的。另一方面，對(duì)于活塞損壞的酸式滴定管，可采取將收集的可用活塞和滴定管活塞套內(nèi)壁多次重新配對(duì)，以使玻璃活塞配合緊密，達(dá)到可用狀態(tài)。將損壞的酸式滴定管經(jīng)相應(yīng)處理后，替代層析柱用于柱色譜分離實(shí)驗(yàn)，這種實(shí)驗(yàn)儀器的改進(jìn)不但沒(méi)有影響柱色譜分離的實(shí)驗(yàn)效果，而且具有一定的優(yōu)點(diǎn)：第一，解決了此實(shí)驗(yàn)層析柱造價(jià)高的弊端，減輕了學(xué)生賠償儀器的經(jīng)濟(jì)壓力。第二，降低了學(xué)校對(duì)此實(shí)驗(yàn)的儀器投入成本。第三，節(jié)約了吸附劑的使用量。本實(shí)驗(yàn)使用的吸附劑為中性氧化鋁，改進(jìn)前進(jìn)行柱色譜分離時(shí)需要中性氧化鋁80克，改進(jìn)后僅消耗20克，大大減少了此實(shí)驗(yàn)所用試劑的經(jīng)費(fèi)投入。

（三）改進(jìn)柱色譜分離技術(shù)

1.改進(jìn)前的操作方法

改進(jìn)前，用80g中性氧化鋁在層析柱中采用干法裝柱。加樣，先用9∶1的石油醚–丙酮洗脫，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)橙黃色色帶流出時(shí)，換一接收瓶接收，它是β-胡蘿卜素。換用7:3的石油醚–丙酮洗脫，當(dāng)?shù)诙€(gè)棕黃色色帶流出時(shí)，換一次接收瓶接收，它是葉黃素。再換用3∶1∶1的正丁醇–乙醇–水洗脫，分別接收葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色）。此種色素分離方法缺點(diǎn)較多，如：干法裝柱極易在中性氧化鋁中形成氣泡而影響色素分離效果，若發(fā)現(xiàn)柱中已有氣泡存在，應(yīng)該設(shè)法將其排除，若不能排掉，則應(yīng)該倒出柱內(nèi)物品重新裝柱。另外分離色素時(shí)所用的正丁醇刺激性強(qiáng)，惡臭使人難忍，屬低毒類物質(zhì)，吞食有害，刺激呼吸系統(tǒng)和皮膚，對(duì)眼睛有嚴(yán)重傷害，其蒸汽使人頭痛、頭暈和困倦，不利于師生健康的同時(shí)還會(huì)污染環(huán)境。

2.改進(jìn)后的柱色譜分離

柱色譜分離的改進(jìn)內(nèi)容：一方面將裝柱方法由干法改進(jìn)為濕法，另一方面將三種洗脫劑改進(jìn)為只用9∶1的石油醚-丙酮一種。改進(jìn)后，具體的柱色譜分離操作為：

1.先進(jìn)行濕法裝柱

將酸式滴定管豎直固定在鐵架臺(tái)上，關(guān)閉活塞，加入9∶1的石油醚–丙酮至滴定管容積的1/4，用干凈的玻璃棒將少量脫脂棉推入滴定管底，擠出其中氣泡，但不可壓得太緊，否則洗脫劑9∶1的石油醚–丙酮將流出太慢或流不出來(lái)。將白沙加入滴定管中，使其在脫脂棉上均勻沉積約5mm厚。將20g中性氧化鋁用9∶1的石油醚–丙酮在燒杯浸潤(rùn)并調(diào)成糊狀。打開(kāi)滴定管活塞，調(diào)節(jié)流速為1滴/秒，將調(diào)好的氧化鋁在攪拌下自滴定管管口緩緩注入管中，同時(shí)用套有乳膠管的玻璃棒輕敲管身，使氧化鋁均勻沉降，形成均勻緊密的氧化鋁柱。加完氧化鋁后，在其沉積面上蓋一張直徑與管內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片。

2.后進(jìn)行色素的洗脫

小心放出酸式滴定管中洗脫劑至液面下降到濾紙片處，關(guān)活塞，將樣品沿管內(nèi)壁緩慢加入，不可沖動(dòng)氧化鋁，否則會(huì)致使氧化鋁表面不平而影響色素分離效果。樣品加完后，開(kāi)活塞，放液至液面降至濾紙片時(shí)，關(guān)活塞，在不沖動(dòng)氧化鋁的情況下，用少許洗脫劑沖洗管內(nèi)壁，再放出液至液面降到濾紙?zhí)?，再?zèng)_洗管內(nèi)壁，直至管壁和所加洗脫劑沒(méi)有顏色。始終保持氧化鋁上面有一段液柱的情況下，不斷加入9∶1的石油醚-丙酮洗脫，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)橙黃色色帶流出時(shí)，換一接收瓶接收，它是β-胡蘿卜素。當(dāng)?shù)诙€(gè)棕黃色色帶流出時(shí)，換一次接收瓶接收，它是葉黃素。當(dāng)?shù)谌齻€(gè)藍(lán)綠色色帶流出時(shí)，換一次接收瓶接收，它是葉綠素a。當(dāng)?shù)谒膫€(gè)黃綠色色帶流出時(shí)，換一次接收瓶接收，它是葉綠素b。

3.經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明

柱色譜分離技術(shù)的改進(jìn)在絲毫未影響以上四種色素的分離效果的同時(shí)，又可以簡(jiǎn)化不斷更換三種洗脫劑的實(shí)驗(yàn)步驟；減少了實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員所配試劑的種類；減少了有毒試劑用后回收處理的工作量；減少了有毒試劑對(duì)師生身體產(chǎn)生的毒害以及對(duì)環(huán)境的污染程度。

三、需注意的問(wèn)題

首先，進(jìn)行濕法裝柱時(shí)，滴定管要垂直于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面；氧化鋁要一次加完，若分多次加入，則因其沉積為多層，且各層交接處的氧化鋁顆粒細(xì)，在分離色素時(shí)易被誤認(rèn)為是一個(gè)色素層；氧化鋁的頂面要裝平，否則易使色素帶傾斜，不能接收到單一組分；在裝柱時(shí)及裝柱后，要始終保持氧化鋁上面有一段洗脫劑柱，以避免空氣進(jìn)入氧化鋁，在其內(nèi)部形成氣泡而影響分離效果。若發(fā)現(xiàn)管中已有氣泡，應(yīng)設(shè)法排除，防止發(fā)生斷層和裂縫現(xiàn)象，若不能排除氣泡，則應(yīng)重新裝柱。

其次，要避免樣品溶液在加樣時(shí)被沖稀，否則易造成色素帶過(guò)寬，各色素的界限不清晰的后果。

最后，控制洗脫劑的流速為1滴/秒。流速太快或太慢都會(huì)影響分離效果。

參考文獻(xiàn)：

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