化學(xué)酶法合成鹽酸度洛西汀的研究進(jìn)展

李龍，邱貴森，蔣泰龍，曾聰明，姚其正

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009；2上海艾美晶生物科技有限公司，上海 201203）

鹽酸度洛西汀[Duloxetine hydrochloride，（S）-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-3-丙胺鹽酸鹽]（結(jié)構(gòu)式見圖 1）是由美國(guó)禮來公司和德國(guó)勃林殷格翰公司共同研發(fā)的新型抗抑郁藥，它是一種5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取雙重抑制劑（serotonin &norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs），在高劑量時(shí)會(huì)產(chǎn)生對(duì)多巴胺（DA）攝取抑制作用，2002年9月獲FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市，用于治療重型抑郁癥和焦慮癥，商品名為“Cymbalta（欣百達(dá)）”；2004年9月FDA批準(zhǔn)用于緩解中樞性疼痛，如糖尿病外周神經(jīng)病性疼痛和婦女纖維肌痛等。2007年4月進(jìn)入我國(guó)。2012年全球20個(gè)最暢銷的處方藥榜單中度洛西汀以49.94億美元的年銷售額排名第9，相對(duì)2011年的年銷售額增漲了16%。目前國(guó)內(nèi)僅有3家企業(yè)獲批生產(chǎn)鹽酸度洛西汀的原料和制劑，分別是上海萬代制藥、上海中西制藥和江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司。

圖1 鹽酸度洛西汀結(jié)構(gòu)式

由于鹽酸度洛西汀中的丙胺端位C原子上連有2-噻吩基和1-萘氧基兩個(gè)不同基團(tuán)，形成不對(duì)稱中心，產(chǎn)生(R)-和(S)-兩種對(duì)映異構(gòu)體。研究發(fā)現(xiàn)(S)-型的鹽酸度洛西汀藥效是(R)-型兩倍，并且，相對(duì)于(R)-鹽酸度洛西汀來說，(S)-型對(duì)映體是更強(qiáng)的5-羥色胺再攝取抑制劑[1]，因而，上市的鹽酸度洛西汀為(S)-型對(duì)映體?？梢姡瑢?duì)映選擇性合成（enantioselective synthesis）鹽酸度洛西汀顯得十分重要，目前合成鹽酸度洛西汀方法主要分為兩類：純化學(xué)法和化學(xué)酶法，這兩種方法要解決的核心問題是制得單一對(duì)映異構(gòu)體：(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇衍生物。在已報(bào)道的多種純化學(xué)法中，主要用化學(xué)拆分法和催化不對(duì)稱合成法，前一種方法是用拆分劑來拆分合成中所產(chǎn)生的(R)/(S)外消旋仲醇混合中間體；后一種方法常用金屬配合物作催化劑，進(jìn)行不對(duì)稱合成，獲得(S)-對(duì)映中間體；兩法在分別獲得各自的(S)-仲醇中間體后，再分別制得(S)-構(gòu)型的鹽酸度洛西汀。純化學(xué)法合成這一藥物有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，并已有較多中外文的綜述發(fā)表，本文將對(duì)化學(xué)酶法合成鹽酸度洛西汀的研究進(jìn)展作一次總結(jié)，以供參考。

1 生物催化概述

生物催化是依托于大規(guī)?；蚪M測(cè)序、定向進(jìn)化、蛋白表達(dá)、代謝工程、高通量篩選和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等技術(shù)而快速發(fā)展起來的[2]。它是以微生物和酶作為催化劑，立體選擇性的合成單一手性化合物的技術(shù)。由于其優(yōu)良的催化特性和環(huán)保等特點(diǎn)[3]，生物催化已經(jīng)在食品添加劑、洗滌劑、藥物和農(nóng)藥的中間體和其他大宗化學(xué)品上得到了應(yīng)用。相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)合成法，生物催化可以較好地滿足對(duì)降低成本、減少污染物、減少能源消耗和提高合成目標(biāo)產(chǎn)物效率（如收率和立體選擇性等）等要求，使之成為一個(gè)有效實(shí)現(xiàn)綠色化學(xué)的方案。生物催化法合成手性化合物主要應(yīng)用酶法拆分與生物催化不對(duì)稱合成這兩種方法（或技術(shù)）。

1.1 酶法拆分（enzymatic resolution）

該技術(shù)最初由Louis Pasteur在1848年首次使用酵母菌成功分離酒石酸銨鹽的外消旋體而建立，它是利用酶立體選擇性地與外消旋體中某一對(duì)映體發(fā)生反應(yīng)而生成不同化合物的特性，從而將兩個(gè)對(duì)映體分開的技術(shù)[4]。按拆分方法可分為動(dòng)力學(xué)拆分、動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分、去消旋化、非水溶劑下酶法拆分等。手性拆分使用的酶有脂肪酶、酯酶、蛋白酶等水解酶，常使用脂肪酶制備度洛西汀的關(guān)鍵中間體。具有特定立體選擇性的脂肪酶的微生物主要有念珠菌屬（Candida）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、曲霉菌屬（Aspergillus）以及根霉菌屬（Rhizopus）等。

1.2 生物催化不對(duì)稱合成（asymmetry synthesis with biocatalysis）

生物催化不對(duì)稱合成是不對(duì)稱合成的一個(gè)分支，是利用純酶或有機(jī)體催化無手性、潛手性化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槭中援a(chǎn)物的過程[5]。根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型可將酶分為水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、連接酶、異構(gòu)酶等。

在生物催化不對(duì)稱合成鹽酸度洛西汀中主要應(yīng)用以下兩種酶：酮還原酶[6]（keto-reductases，簡(jiǎn)寫為KRED）和羥腈裂解酶[7]（hydroxynitrile lyases，簡(jiǎn)寫為 HNLs），以解決制得(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇衍生物的問題，為合成度洛西汀提供關(guān)鍵手性中間體。

1.2.1 酮還原酶（KRED）

酮還原酶屬于氧化還原酶系，能夠?qū)τ尺x擇性地將酮羰基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的手性仲醇。這些酶需要輔酶的參與，在以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（NADPH）作為氫源的條件下，利用輔酶甲酸脫氫酶（FDH）將甲酸氧化成二氧化碳或葡萄糖脫氫酶（GDH）[8]將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同時(shí)所釋放的氫在輔酶作用下，可分別使NAD或NADP再生為NADH或NADPH，具體過程見圖2。酮還原酶活性可以通過測(cè)量NADPH吸光度或熒光的減少來標(biāo)定。

1.2.2 羥腈裂解酶（HNLs）

圖2 酮還原酶參與的不對(duì)稱合成原理

羥腈裂解酶屬于裂解酶系，它可以使氫氰酸加成到酮類或醛類化合物上，立體選擇性的生成手性氰（基）醇化合物。早在1908年Roseenthaler便用杏仁中的HNLs進(jìn)行過不對(duì)稱合成實(shí)驗(yàn)，但是當(dāng)時(shí)此研究結(jié)果并沒有得到足夠的重視，直到最近 30年，人們才又認(rèn)識(shí)到它在手性化合物合成中的重要性。(R)-HNLs多存在于擬南芥（Arabidopsis thaliana），薔薇科（如杏仁、黑櫻桃、桂櫻、杏、桃、李、蘋果、梨等）亞麻屬植物中[9]；(S)-HNLs多存在于大戟科（如橡膠樹屬、木薯屬、高粱屬）等植物中。目前人們已經(jīng)透徹認(rèn)識(shí)了羥腈裂解酶的氨基酸序列及其作用機(jī)理，并能熟練的運(yùn)用相關(guān)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化及重組表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)上所用的HNLs多為優(yōu)化后的重組酶或突變酶。生成氰醇的反應(yīng)原理見圖3。

圖3 羥腈裂解酶參與的不對(duì)稱合成原理

在化學(xué)酶催化法制備鹽酸度洛西汀的工藝路線中，根據(jù)所用酶的種類可主要分為三大類合成路線。

2 脂肪酶催化合成路線

2.1 路線一

該路線以2-氯-1-(噻吩-2-基)乙酮（簡(jiǎn)稱1，下同）為原料，經(jīng)NaBH4還原生成消旋體2-氯-1-(噻吩-2-基)乙醇（2），2與 NaCN反應(yīng)得化合物 3，3與乙酸乙烯酯反應(yīng)，經(jīng)脂肪酶拆分后得到(S)-a和(R)-b，后者消旋后經(jīng)脂肪酶拆分得到(R)-a（該對(duì)映體可被消旋得3，再重復(fù)3以后的過程）和(S)-b[10]。將(S)-a和(S)-b先用硼烷/二甲硫醚還原，后與氯甲酸乙酯反應(yīng)得到關(guān)鍵手性中間體：(S)-[3-羥基-3-(噻吩-2-基)丙基]氨基甲酸乙酯（5），5用 LiAlH4還原得(S)-3-甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（6），6 在NaH作用下與1-氟萘縮合得到最終產(chǎn)物（見圖4）。此法采用動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分的方法獲得對(duì)映體化合物5，減少了拆分帶來的異構(gòu)體損失，但是該法合成路線較長(zhǎng)、操作復(fù)雜、總收率只有 16.8%，且用到劇毒物質(zhì)NaCN，因此，工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。

2.2 路線二

圖4 以2-氯-1-（噻吩-2-基）乙酮為原料制備度洛西?。肪€一）

圖5 以3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮為原料制備度洛西?。肪€二）

該路線以 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮（7）為原料，先用NaBH4還原生成化合物8，8經(jīng)脂肪酶拆分得到(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（9），9 與NaI反應(yīng)生成化合物10，10與CH3NH2反應(yīng)生成化合物6，6在NaH作用下與1-氟萘縮合得到最終產(chǎn)物（見圖 5）[11]。此法反應(yīng)條件溫和，脂肪酶易回收，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，但是原料7不易制得，化合物分離存在一定的難度，因此工業(yè)化價(jià)值不高。

3 酮還原酶催化合成路線

3.1 路線三

該路線由CODEXIS開發(fā)，所用酮還原酶（源自于乳酸短桿菌），經(jīng)過重組構(gòu)建出了一系列的ADH-LK。首先 2-乙酰噻吩（11）與(HCHO)n和CH3NH2·HCl發(fā)生Mannich反應(yīng)生成化合物12，12在酶催化下合成(S)-對(duì)映異構(gòu)體化合物6，6在NaH作用下與 1-氟萘發(fā)生反應(yīng)得到最終產(chǎn)物（見圖6）[12]。此法原料較廉價(jià)，合成路線簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，酶催化效率（100g/L底物最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95%）和產(chǎn)物ee值較高（≥99%），有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

3.2 路線四

該路線由BASF SE開發(fā)，所用酮還原酶源自于固氮弧菌屬物種 EbN1[13]及其突變菌株[14-15]。以 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮（7）為原料，在酶的催化下不對(duì)稱合成化合物9，9與NaI發(fā)生取代反應(yīng)生成化合物10，10與CH3NH2反應(yīng)生成化合物6，6在 NaH作用下與 1-氟萘反應(yīng)生成最終產(chǎn)物（見圖7）。此法雖反應(yīng)條件溫和，路線簡(jiǎn)潔，綠色環(huán)保，但是與路線二相似，因原料7制備困難，商品化供應(yīng)較少，工業(yè)化應(yīng)用受到影響。

圖6 以2-乙酰噻吩為原料制備鹽酸度洛西?。肪€三）

圖7 以3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮為原料制備度洛西?。肪€四）

3.3 路線五

該路線[16]由印度國(guó)家醫(yī)藥教育和研究學(xué)會(huì)開發(fā)，所用酮還原酶最初源自于熱帶假絲酵母屬菌株P(guān)BR-2。CODEXIS公司[17]對(duì) PBR-2進(jìn)行了改進(jìn)，并通過突變和重組篩選出了高效的菌株。首先，2-乙酰噻吩與(HCHO)n和CH3NHCH3發(fā)生Mannich反應(yīng)，生成化合物13，13在酶的催化下還原制得(S)-3-二甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（14），14 在 NaH作用下與 1-氟萘反應(yīng)生成化合物 15，15在鋅粉和ClCO2CH2CCl3作用下去一甲基得到最終產(chǎn)物（見圖8）[18]。此路線與目前工業(yè)上大規(guī)?；瘜W(xué)法生產(chǎn)度洛西汀的路線大致相同，但使用生物酶制備(S)-型手性仲醇可達(dá)到84%～88%的轉(zhuǎn)化率，且ee%≥99%，相對(duì)于化學(xué)法制備(S)-型手性仲醇有較大的優(yōu)勢(shì)。

3.4 路線六

Masaru等[19]對(duì)來源于短小桿菌屬菌株 F42的酮還原酶進(jìn)行分析，并構(gòu)建了一株新的菌株不對(duì)稱合成化合物17。此法以2-乙酰噻吩為原料，先與碳酸二乙酯反應(yīng)生成化合物16，化合物16在酶催化下得到化合物17，化合物17在MeOH和MeNH2作用下得到化合物6，然后化合物6在NaH作用下與1-氟萘反應(yīng)生成終產(chǎn)物（見圖9）[20]。其中的酶催化制備的(S)-型手性醇化合物17的穩(wěn)定性差，容易發(fā)生水解。中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所湯傳根等[21]合成出了化合物18，以此為底物篩選出一株黏紅酵母 CY12，在該菌株催化下得到了能夠在水溶液中穩(wěn)定存在手性化合物19，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率也能達(dá)到95%，且ee為96%，但是受原料和底物耐受性的限制，工業(yè)化意義不大。

圖8 以2-乙酰噻吩為原料制備鹽酸度洛西汀（路線五）

圖9 以2-乙酰噻吩為原料制備鹽酸度洛西?。肪€六）

4 羥腈裂解酶催化合成路線

Annika等[22]以2-噻吩甲醛（20）為原料，采用化學(xué)酶拆分法合成出鹽酸度洛西??；Rohan等[23]同樣以20為原料，利用羥腈裂解酶作為催化劑也得到了鹽酸度洛西汀。該路線以2-噻吩甲醛（20）為起始物，使用一種新發(fā)現(xiàn)的來自白杏的?-型羥腈裂解酶催化制得(S)-2-羥基-2-(噻吩-2-基)乙腈（21），21與 DIBAL-H在?78℃下還原水解生成醛基化合物22，22在LiHMDS和Ph3PCH2作用下生成(S)-1-羥基-1-(噻吩-2-基)丙-2-烯（23），23 在 H2O2與Me2SBH3作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成化合物24，24與CH3NH2發(fā)生反應(yīng)生成化合物6，6在NaH作用下與1-氟萘反應(yīng)得到最終產(chǎn)物（見圖10）。此法原料易得，但是最終收率只能達(dá)到21%，合成路線中部分反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)步驟較繁瑣，工業(yè)化意義不大。

圖10 以2-噻吩甲醛為原料制備鹽酸度洛西汀

5 結(jié) 語

在化學(xué)酶催化法制備鹽酸度洛西汀過程中，主要通過酶法拆分和生物催化不對(duì)稱合成關(guān)鍵單一手性中間體：(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇及其衍生物，由此所形成的多種合成路線具有反應(yīng)條件較溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，其中路線三和路線五展現(xiàn)出了較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

由于醇以及手性仲、叔醇是有機(jī)合成中最基礎(chǔ)、最重要的原料，用化學(xué)酶法合成醇等基礎(chǔ)有機(jī)化合物受到普遍重視。盡管目前微生物及酶的催化效率、重復(fù)使用率、底物的耐受性和產(chǎn)物分離等一系列問題阻礙了生物催化大規(guī)模工業(yè)化的進(jìn)程，但是這些難題隨著高通量篩選、DNA重組技術(shù)、易錯(cuò)PCR、基因組學(xué)和定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，并且伴隨著催化劑工程、介質(zhì)工程、過程工程等技術(shù)的緊密結(jié)合而終將得以解決，這些發(fā)展也將有力地推動(dòng)著手性仲醇或叔醇的合成，為人們提供結(jié)構(gòu)更豐富、產(chǎn)量更大和應(yīng)用價(jià)值更高的手性純化合物。生物催化已進(jìn)入快速發(fā)展的新時(shí)期，正在影響著食品、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品行業(yè)的工業(yè)生產(chǎn)模式，使這些產(chǎn)品的生產(chǎn)過程對(duì)環(huán)境也更加的友好。

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