高效液相色譜法測(cè)定三金顆粒中羥基積雪草苷含量

朱雪妍，林燕翔

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

三金顆粒是由金櫻根、金剛刺、羊開(kāi)口等5味中藥制備而成，具有清熱解毒、利濕通淋、益腎的功效。目前三金顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]均過(guò)于簡(jiǎn)單，沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)目。為確保臨床療效及有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者以羥基積雪草苷[2－3]作為含量測(cè)定指標(biāo)，建立了三金顆粒中積雪草[4]的含量測(cè)定方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀；Chemstation色譜工作站；MILLIPROA純水處理器。羥基積雪草苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110893－200201，供含量測(cè)定用，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定純度為97．35%）；三金顆粒（市售品）；乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：ODS Hypersil C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈 －2 mmol／L β－環(huán)糊精溶液（24 ∶76）；流速：1．0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

取羥基積雪草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0．2 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 320 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓回收至干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，取正丁醇液，減壓回收至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺積雪草陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，制備得陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2．1項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1，表明陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取羥基積雪草苷對(duì)照品22．48 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密吸取以上對(duì)照品溶液 0．1，0．3，1．0，5．0，10．0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密量取以上溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝182．48X＋5．454 4，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，羥基積雪草苷進(jìn)樣量在 0．218 8 ～21．884 3 μg范圍內(nèi)峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果羥基積雪草苷峰面積的RSD為0．35%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液（批號(hào)為100701），每隔一定時(shí)間測(cè)定1次，共測(cè)定5次。結(jié)果羥基積雪草苷峰面積的RSD＝1．36%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為100701），依法制備供試品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定6次。結(jié)果羥基積雪草苷平均含量為 0．097 31 mg／g，RSD＝2．41%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取羥基積雪草苷對(duì)照品20．46 mg（含量為97．35%），精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取 2．00，5．00，10．00 mL，分別置 200 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液A，B，C。取已知含量的樣品（批號(hào)為100701，羥基積雪草苷含量為0．097 31 mg／g），研細(xì)，取約5 g，精密稱定（共9份），置錐形瓶中，分為3組，分別精密加入對(duì)照品溶液A，B，C 50 mL，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液并依法測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羥基積雪草苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2．4 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，按擬訂的方法測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）

3 討論

曾用ODS HYPERSIL C18柱，Symmetry及Kromasil C18柱等不同品牌色譜柱測(cè)定同一樣品（批號(hào)為100701）含量，結(jié)果色譜圖中羥基積雪草苷峰與相鄰雜質(zhì)峰分離良好，理論板數(shù)均在5 000以上，且3根不同品牌色譜柱測(cè)得的羥基積雪草苷含量的RSD為25%，說(shuō)明系統(tǒng)適用性良好。

對(duì)于樣品提取方法，分別用超聲提取和加熱回流提取進(jìn)行比較，結(jié)果以超聲提取較完全；對(duì)提取溶劑甲醇、80%甲醇、無(wú)水乙醇進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，采用甲醇提取較為完全；還對(duì)提取時(shí)間（20，30，60 min）進(jìn)行了考察，結(jié)果以30 min和60 min提取的更完全，且相差不大；再對(duì)水飽和的正丁醇萃取次數(shù)（2，3，4次，每次20 mL）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，萃取3次即可提取完全；最后比較了用氨試液洗滌次數(shù)（1，2，3次，每次20 mL），結(jié)果表明通過(guò)堿洗能大大減少雜質(zhì)對(duì)色譜分析的影響，且洗滌2次即可除去較多的雜質(zhì)。

[1]WS3－B－3746－98．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二十冊(cè)）[S]．

[2]陳云艷，翁小香，周 靖，等．積雪草總苷及其制劑的含量研究．Ⅱ．積雪草總苷中積雪草苷，羥基積雪草苷和積雪草苷B含量的HPLC法測(cè)定[J]．中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（4）：276 －279．

[3]楊于琴，丁永輝，夏玉鳳．積雪草活性成分的分析方法及藥理作用研究進(jìn)展[J]．中國(guó)野生植物資源，2010，29（3）：6 －9．

[4]齊紅梅，王冬梅．積雪草化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J]．中國(guó)藥業(yè)，2010，19（16）：89 － 90．