桑枝中黃酮類的HPLC指紋圖譜的研究

孫 蓮, 嚴寒信, 姑再努爾·阿布力孜

(1新疆醫(yī)科大學藥學院化學教研室, 烏魯木齊 830011； 2烏魯木齊市61中學, 烏魯木齊 830000)

桑枝(RamulusMori)是?？粕僦参锷?MorusalbaL.)的一年生干燥嫩枝，是中醫(yī)常用的傳統(tǒng)藥材，具有祛風活絡、通利關(guān)節(jié)、燥濕利水之功效[1]。桑枝中的主要功效成分為黃酮類和生物堿類，現(xiàn)代藥理學研究證明，桑枝黃酮具有抗炎、抗氧化、抗衰老、防癌、抗?jié)儭⒔獐d、抗菌、提高機體免疫功能以及降糖降脂等多種功能[2-8]。建立桑枝中黃酮類等物質(zhì)指紋圖譜分析對桑枝的質(zhì)量控制十分必要[9-13]。本實驗對10批次桑枝藥材中黃酮類成分進行指紋圖譜的分析，為新疆桑枝的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(日本島津，LC-20A)，二極管陣列檢測器(日本島津SPD-M10Avp)，KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山 40KHz 200W)。

1.2試藥異槲皮苷對照品(上海晶純醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號27988) ，紫云英苷對照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號 MUST-11092001)。乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。桑枝分別采自新疆烏魯木齊、喀什市、疏勒縣、昌吉、和田、阿克蘇市、塔城、吐魯番、哈密、伊犁地區(qū)，由新疆醫(yī)科大學藥學院生藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為桑的一年生干燥嫩枝(RamulusMori)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：YMC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為0.1%的磷酸水溶液，B為0.2%的磷酸乙腈溶液，梯度洗脫：0 min(A-B，85∶15)，9 min (A-B，80∶20)，20 min (A- B，75∶25)，30 min(A-B，65∶35)，40 min(A-B，60∶40)；柱溫30℃；流速1.0 mL/ min；檢測波長360 nm；進樣10 μL。上述色譜條件下的對照品及吐魯番地區(qū)桑枝的色譜圖見圖1、2。

A: 異槲皮苷; B: 紫云英苷圖1 對照品色譜圖

A: 異槲皮苷; B: 紫云英苷圖2 吐魯番地區(qū)桑枝樣品色譜圖

2.2溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取紫云英苷及異槲皮苷各5.0 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.5 mg/mL的紫云英苷及異槲皮苷對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取10個地區(qū)的桑枝樣品5.0 g(過60目篩，60 ℃干燥至恒重) ，置于250 mL三角瓶中，加30 mL石油醚，超聲20 min(20℃水浴)，過濾，濾渣揮干溶劑后，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，于35℃時超提取40 min，4 000 r/min離心2 min，上清液移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用時過0.45 μm的微孔濾膜。

2.3方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份桑枝藥材1份，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，在選定的色譜條件重復進樣6次，記錄色譜峰，計算各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.2%～1.0% 和0.6%～2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同批桑枝藥材5份，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別測定，計算各共有峰相對保留時間RSD<1.1%,相對峰面積RSD<2.0%,表明方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 將上述制備的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件于0、2、8、16、24 h 測定，計算各色譜峰相對保留時間RSD<1.2%,相對峰面積RSD<1.6%,表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4桑枝藥材指紋圖譜的建立分別精密吸取不同產(chǎn)地供試品溶液10 μL進樣，記錄各批次圖譜，圖3為烏魯木齊市桑枝圖譜。發(fā)現(xiàn)11個特征峰是10批次桑枝所共有的，確定這11個峰為特征指紋峰。經(jīng)與對照品圖譜比較，確定其中6號峰為異槲皮苷，8號峰為紫云英苷，從圖1中可知紫云英苷的分離度較好，保留時間適中，峰面積較大，因此選擇8號峰(紫云英苷)作為參照峰(S峰)。10個不同產(chǎn)地桑枝藥材指紋圖譜疊圖，見圖4。

圖3 桑枝藥材對照峰的HPLC指紋圖譜

圖4 不同批次桑枝藥材的HPLC指紋圖譜

2.5相似度分析將10個不同產(chǎn)地桑枝的測試數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004年A版相似度軟件，進行相似度的評價。結(jié)果表明，各樣品相似度均>0.90，不同產(chǎn)地藥材圖譜具有很高的相關(guān)性，不同來源的桑枝主要成分基本相同，部分成分的相對含量存在差異(表1)。

表1 桑枝藥材的相似度

3 討論

3.1提取溶劑及提取方法的選擇考察了水、不同濃度甲醇(60%、70%、80%、90%、100%)為提取溶劑在超聲提取、索式提取及回流提取時的提取率，結(jié)果表明甲醇回流提取率最高。

3.2流動相的選擇本研究比較了流動相為磷酸-乙睛和磷酸-甲醇系統(tǒng)時的色譜圖，結(jié)果顯示前者柱壓較低，且進行梯度洗脫時，流動相比例的改變對其基線影響較小，分離度好。對以0.1%磷酸水溶液、0.2%磷酸水溶液、0.4%磷酸水溶液、甲酸水溶液為流動相的A相，乙腈、不同濃度的磷酸乙腈溶液為流動相的B相進行試驗，結(jié)果表明，0.1%磷酸水溶液為A相和0.2%磷酸乙腈溶液為B相梯度洗脫時，藥桑枝中的黃酮類成分分離得最好，峰形對稱，指紋圖譜結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

3.3檢測波長的選擇采用二極管陣列對異槲皮苷及紫云英苷進行200～400 nm的紫外掃描，在360 nm及254 nm處有最大吸收，檢測波長為360 nm時，峰數(shù)較多，分離較好，信號響應強度適當。故本實驗選擇360 nm作為藥桑枝指紋圖譜的檢測波長。

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 2010年版[S]. 一部. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:280.

[2] 章丹丹,唐寧,華曉東,等. 桑枝提取部位及其組合對巨噬細胞炎癥介質(zhì)的影響[J]. 中草藥,2013,44(2):186-192.

[3] 邢冬杰，李廣元,孫永慶,等. 桑枝提取物對糖尿病大鼠的作用研究[J]. 中國實用醫(yī)藥,2010,5(9):29-30.

[4] 耿鵬,朱元元,楊洋,等. 桑枝生物堿與兒茶素的降血糖作用[J]. 中草藥,2007,38(8):1228-1230.

[5] 李明娟,李季,姜晨露．桑枝顆粒提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究[J]．中國實用醫(yī)學,2009,4(6):166-67．

[6] 梁永鋒．桑樹枝條化學成分研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(18):8455-8456．

[7] 李孟璇,管福,孫搖視,等. 桑枝中苯并呋喃類化合物結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤活性的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2010,21(12):3343-3344.

[8] 章丹丹,高月紅,Jessica Tao Li,等. 桑枝總黃酮的抗氧化活性研究[J]. 中成藥，2011，33(6)：943-946.

[9] 王巍,鞠成國,趙煥君. 急性子中黃酮類成分HPLC指紋圖譜的初步研究[J]. 中成藥，2011,33(2):199-203.

[10] 呂瑞凰,徐建國,徐芳,等. 天山雪蓮高效液相指紋圖譜研究[J]. 新疆醫(yī)科大學學報，2010,33(8):285-287.

[11] 歐元,袁曉凡,徐春明,等. 天山雪蓮HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥,2008,39(1)：105-108.

[12] 陳志紅,徐美奕,龔先玲. 紫荊花黃酮類化合物的HPLC指紋圖譜研究[J]. 中國藥房,2010,21(31):2928.

[13] 鐘輝. 絞股藍黃酮指紋圖譜研究[J]. 湖北中醫(yī)學院學報,2010,12(3):31-33.