實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)中的應(yīng)用△

周婧 管懷進(jìn)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)是最常見的致盲性眼病[1-2]，其病因和發(fā)病機(jī)制迄今仍不清楚。公認(rèn)的危險(xiǎn)因素除了紫外線照射等外源性因素外，衰老、心血管疾病等內(nèi)源性代謝產(chǎn)生的自由基和活性氧也會(huì)引起氧化損傷，致使晶狀體的DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生過氧化作用，最終導(dǎo)致晶狀體混濁。而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase，GST)被認(rèn)為是保護(hù)晶狀體免受氧化損傷的重要酶。GST主要通過催化還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)與毒性化合物結(jié)合而清除自由基，抑制晶狀體發(fā)生氧化損傷從而抑制白內(nèi)障。然而，不同個(gè)體的清除能力存在明顯差異，造成這種差異的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)很大程度上來源于基因多態(tài)性。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ARC患者GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)多態(tài)性，以探討GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)變異是否與ARC有關(guān)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象2008年6月至8月間，從“江蘇眼病研究”南通流行病學(xué)調(diào)查基地[3]收集ARC組患者279例(558眼)，年齡(69.0±8.4)歲；對(duì)照組145例(290眼)，年齡(64.5±4.2)歲；男175例，女249例，均為漢族人(所有人四代內(nèi)均為中國(guó)漢族人)。ARC組包括131例皮質(zhì)性白內(nèi)障、70例核性白內(nèi)障、78例后囊下性白內(nèi)障患者。本研究遵循赫爾辛基宣言，獲得南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)為2010-05)，檢查前所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.1ARC組納入與排除標(biāo)準(zhǔn)晶狀體混濁標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]，包括空泡、水裂、板層分離、輪幅狀混濁、楔形混濁、核混濁及后囊膜下混濁等，不包括少數(shù)對(duì)視力無影響的點(diǎn)狀混濁；最佳矯正視力<0.7；年齡≥60歲。排除糖尿病、外傷、近視、青光眼、視網(wǎng)膜脫離及其他原因引起的并發(fā)性白內(nèi)障，排除雙眼中任一眼為人工晶狀體眼或無晶狀體眼，排除明顯全身性疾病，排除自由基相關(guān)疾病如糖尿病、心血管疾病、腎臟病和癌癥等。

1.1.2對(duì)照組納入與排除標(biāo)準(zhǔn)晶狀體透明，雙眼最佳矯正視力>0.8，年齡≥60歲，與ARC組無親屬關(guān)系，均無ARC家族史，與ARC組年齡、性別相匹配。排除青光眼、葡萄膜炎等眼病，排除全身性疾病及自由基氧化損傷相關(guān)疾病。

1.1.3觀察項(xiàng)目上午700～1000我們對(duì)所有受檢者進(jìn)行問卷調(diào)查，排除全身性氧化損傷相關(guān)疾病史；并對(duì)受檢者血壓、肝腎功能、血糖、電解質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，排除腎臟疾病和血糖水平異常的情況(空腹血糖>6.05 mmol·L-1)。對(duì)所有ARC患者和對(duì)照組人群進(jìn)行全面的眼部檢查，包括視力檢查，散瞳后用裂隙燈顯微鏡和直接檢眼鏡進(jìn)行眼附屬器、角膜、前房、晶狀體、玻璃體及視網(wǎng)膜等的檢查(淺前房者不進(jìn)行散瞳檢查)。使用LOCSⅡ分級(jí)系統(tǒng)對(duì)晶狀體混濁狀態(tài)進(jìn)行分級(jí)。

1.2主要試劑及儀器DNA血提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，TaqMan探針和引物、FAM-標(biāo)記基因分析試劑盒、VIC-標(biāo)記基因分析試劑盒、人類基因組DNA對(duì)照(美國(guó)ABI 公司)。裂隙燈顯微鏡、Y26H檢眼鏡(蘇州六六醫(yī)療器械股份有限公司)，電熱恒溫水溫箱(上海聯(lián)進(jìn)醫(yī)療器械廠)，超凈工作臺(tái)(蘇州蘇進(jìn)集團(tuán))，低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)GE 公司)，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、7500型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)軟件(美國(guó)ABI公司)。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取抽取ARC組和對(duì)照組外周靜脈血2 mL，按Qiagen方法(按照使用說明)提取DNA洗脫至200 μL，-20 ℃儲(chǔ)存。

1.3.2DNA濃度測(cè)定DNA提取后，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度和純度。OD260/OD280比值用于評(píng)估DNA的純度，理想的OD260/OD280比值為1.7～2.0。所測(cè)的樣本DNA濃度為60～120 ng·mL-1，OD260/OD280為1.6～2.0，符合試驗(yàn)要求。

1.3.3引物、TaqMan探針合成購(gòu)買試驗(yàn)所用的GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)檢測(cè)的TaqMan探針(FAM標(biāo)記)和引物[4]，以RNase P為內(nèi)參照(RNase P在基因組中的拷貝數(shù)恒定為2，探針為VIC標(biāo)記)。引物和探針序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR目的基因擴(kuò)增的探針和引物序列

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體外擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系為25 μL，包括2×TaqMan PCR混合液12.5 μL，10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL，10 μmol·L-1TaqMan探針1 μL，100 mg·L-1DNA 0.2 μL，余下的用去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)設(shè)立內(nèi)對(duì)照RNase P基因。每個(gè)樣本進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)均重復(fù)3次，反應(yīng)在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.3.5目的基因相對(duì)拷貝數(shù)計(jì)算應(yīng)用△△Ct法，與內(nèi)對(duì)照RNase P基因比較可以得出GSTM1、GSTT1基因的相對(duì)拷貝數(shù)(Ct值)，△Ct是代表每個(gè)樣本3次重復(fù)的平均Ct值，△△Ct=(CtGSTsample-CtRNase Psample)-(CtGSTcalibrator-CtRNase Pcalibrator)，Ct目的基因=2-△△Ct。用CopyCaller軟件計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量，分析GSTM1、GSTT1基因的拷貝數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Stata 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析ARC組和對(duì)照組的相對(duì)危險(xiǎn)度(relative odds，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。

2 結(jié)果

2.1目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率及目的基因不同拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光分析圖各樣本DNA的GSTM1、GSTT1基因和RNase P基因3次PCR擴(kuò)增曲線基本重合、擴(kuò)增效率基本一致，Ct值基本相同(圖1)。所有樣本目的基因Ct值>39定義為0個(gè)拷貝，RNase P基因Ct值>27定義為0個(gè)拷貝。CopyCaller軟件計(jì)算結(jié)果顯示：拷貝數(shù)為0、1、2和>2的GSTM1基因與RNase P基因Ct值的差值平均值分別為0.142 17、-0.134 58、-0.986 76和-1.691 63。拷貝數(shù)為0、1、2和>2的GSTT1基因與RNase P基因Ct值的差值平均值分別為0.001 79、0.125 17、-0.780 88和-1.440 14。

Figure 1 Amplification curve of GSTM1 and RNaseP gene.Three PCR amplification curves of GSTM1 and RNase P gene were basically coincidence,and Ct values were basically same GSTM1基因和RNase P基因的擴(kuò)增曲線圖。GSTM1基因和 RNase P基因3次PCR擴(kuò)增曲線基本重合，Ct值基本相同

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)分布情況

2.2.1ARC組和對(duì)照組GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)的分布情況ARC組GSTM1基因拷貝數(shù)為0、1、2和>2的患者分別為171例、67例、28例和13例(表2)，對(duì)照組GSTM1基因拷貝數(shù)為0、1、2和>2的患者分別為95例、28例、14例和8例。ARC組GSTT1基因拷貝數(shù)為0、1、2和>2的患者分別為146例、100例、23例和10例，對(duì)照組GSTT1基因拷貝數(shù)為0、1、2和>2的患者分別為60例、54例、20例和11例。GSTM1基因拷貝數(shù)變異的ARC個(gè)體與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。GSTT1基因完全缺失(0個(gè)拷貝)的ARC個(gè)體和對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，OR=1.56，95%CI為1.02-2.38)；至少有1個(gè)拷貝缺失GSTT1基因型的個(gè)體發(fā)生ARC的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(P<0.01，OR=2.16，95%CI為1.27-3.67)。

表2 ARC組和對(duì)照組GST的基因型分布

2.2.2不同類型的ARC組與對(duì)照組GSTT1拷貝數(shù)分布比較至少有1個(gè)拷貝缺失的GSTT1基因型的患者皮質(zhì)性ARC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)升高(表3)，OR值為4.81(P<0.001)，而>2個(gè)拷貝缺失的GSTT1基因型的患者這種風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.19，P<0.05)。GSTT1基因完全缺失(0個(gè)拷貝)的后囊下性ARC組和對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而GSTT1不同基因型的核性ARC組和對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各類型的ARC組和對(duì)照組GSTT1的基因型分布

3 討論

近年來，隨著人類基因組中拷貝數(shù)變異的大量發(fā)現(xiàn)，遺傳變異研究的熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移至包含拷貝數(shù)變異的結(jié)構(gòu)變異上[5-6]?？截悢?shù)變異是指人類基因組內(nèi)從1 kb到幾個(gè)Mb的DNA片段拷貝數(shù)的不同，包括DNA片段的插入、刪除、復(fù)制和復(fù)合多位點(diǎn)的變異[6]等類型，其在整個(gè)基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)至少是單核苷酸多態(tài)性的3倍，因此，拷貝數(shù)變異可能在遺傳變異方面起著比單核苷酸多態(tài)性更為重要的作用[5]。

以往檢測(cè)基因拷貝增加或缺失的最常見的方法包括免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白過表達(dá)、熒光原位雜交技術(shù)、比較基因組雜交和普通PCR。由于基因分型方法的限制，上述研究只能區(qū)別基因的有或無，卻無法辨別個(gè)體攜帶的基因多個(gè)拷貝量的變化。Marianne等[7]改進(jìn)了PCR技術(shù)，通過內(nèi)參基因的使用對(duì)大樣本人群GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)精確定量，此種qRT-PCR技術(shù)有效解決了傳統(tǒng)定量檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)強(qiáng)度，在2 h內(nèi)完成對(duì)單次PCR擴(kuò)增反應(yīng)的384個(gè)DNA樣本基因型的檢測(cè)，并記錄在電腦中，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因和內(nèi)參的Ct差值的比較，對(duì)起始DNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量，將基因存在的情況深入到基因具體拷貝的數(shù)量，從而精確分析基因拷貝數(shù)變異與疾病的關(guān)系。

本研究使用改進(jìn)的qRT-PCR技術(shù)精確地檢測(cè)了ARC患者抗氧化損傷基因GSTM1、GSTT1的拷貝數(shù)，通過高通量地處理和分析qRT-PCR試驗(yàn)的基因擴(kuò)增數(shù)據(jù)，探討氧化損傷清除基因GSTM1、GSTT1的拷貝數(shù)變異與ARC易感性之間的關(guān)系。

本研究表明，GSTM1基因拷貝數(shù)變異與ARC的易感性無關(guān)，而GSTT1基因拷貝數(shù)變異與ARC特別是皮質(zhì)性ARC的易感性有關(guān)。上述結(jié)果與以前的研究報(bào)道不同[8-10]，這可能與以往的研究方法存在缺陷，只能區(qū)別基因存在或缺失，卻不能辨別一個(gè)或多個(gè)拷貝的基因型有關(guān)，且可能與各人群拷貝數(shù)變異的頻率不同所導(dǎo)致GST-ARC的易感性差異有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)：這種改進(jìn)的qRT-PCR技術(shù)能更精確地闡述GSTM1/GSTT1拷貝數(shù)變異對(duì)ARC的影響，研究顯示>2個(gè)拷貝GSTT1基因型對(duì)皮質(zhì)性ARC起著保護(hù)作用；GSTT1基因拷貝數(shù)變異與ARC特別是皮質(zhì)性白內(nèi)障有關(guān)，但與其他類型的ARC無關(guān)。有研究認(rèn)為在晶狀體周邊及赤道部分GST活性最高，而在核內(nèi)GST活性最低[11]，因此我們的研究結(jié)果可能與晶狀體中GST酶活性的分布不同有關(guān)。

不同種族人群中拷貝數(shù)變異的數(shù)據(jù)資料很少。在高加索人中，GSTM1、GSTT1完全缺失的頻率分別為44.4%～53.8%和17.9%～29.0%[12-15]，在韓國(guó)人中分別為38.2%～58.3%和49.7%～54.3%[16-18]，日本人中分別為51.3%～56.2%和47.5%～54.0%[19-21]。本研究選取的人群來自同一眼病流行病學(xué)調(diào)查基地，這部分≥60歲的常住漢族人口所處的地理特征相同，克服了流行病學(xué)調(diào)查中的選擇偏倚。

本研究將qRT-PCR技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)GSTM1、GSTT1基因拷貝數(shù)多態(tài)性上，國(guó)內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。該方法簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果穩(wěn)定可靠，能有效克服傳統(tǒng)方法所不能區(qū)別基因劑量的缺點(diǎn)，適用于流行病學(xué)調(diào)查中不同人群的基因與眼病易感性的關(guān)聯(lián)研究，值得大力推廣。

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