地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)模擬與序列分析

余磊　韓雅莉

摘要：為了研究地鱉蟲(chóng)（Eupolyphage sinensis Walker）纖溶酶的溶栓機(jī)理，根據(jù)地鱉蟲(chóng)纖溶酶成熟肽編碼序列，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，用Biosun軟件的同源模建技術(shù)，模擬了其三維結(jié)構(gòu)。利用GOLDKEY軟件，對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的氨基酸序列進(jìn)行了分析，討論了其等電點(diǎn)、親水性、柔性與催化活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心是組氨酸、絲氨酸和天冬氨酸3個(gè)氨基酸殘基，位于球蛋白中心凹穴處，底物結(jié)合部位是絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，該類(lèi)酶水解纖維蛋白的機(jī)理是催化精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵水解。

關(guān)鍵詞：地鱉蟲(chóng)（Eupolyphage sinensis Walker）；纖溶酶；三維結(jié)構(gòu)；序列

中圖分類(lèi)號(hào)：Q55；R857.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-1185-04

地鱉蟲(chóng) （Eupolyphage sinensis Walker）又名土元、土鱉，屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲(chóng)，為《中華人民共和國(guó)藥典》記載的正品藥材，是傳統(tǒng)的活血化瘀類(lèi)動(dòng)物藥，其藥用功效主要為逐瘀、破積、通絡(luò)等。廣東工業(yè)大學(xué)纖溶先導(dǎo)藥物課題組在進(jìn)行地鱉蟲(chóng)纖溶活性成分研究時(shí)，從該蟲(chóng)體內(nèi)分離純化得到了地鱉蟲(chóng)纖溶酶[1，2]，對(duì)此類(lèi)纖溶酶基因 DNA序列進(jìn)行了分析研究，克隆得到其中一種地鱉蟲(chóng)纖溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：DQ396618），并將其用赤畢酵母表達(dá)[3]。為了深入探討地鱉蟲(chóng)纖溶酶的纖溶作用機(jī)制，確定其活性中心的位置，本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列進(jìn)行多方位分析，并建立了地鱉蟲(chóng)纖溶酶可靠的三維結(jié)構(gòu)模型，揭示了其纖溶機(jī)理，為今后進(jìn)一步研究提供參考。

1 理論與方法

要想了解蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，只有將蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶，利用X射線衍射分析蛋白質(zhì)的單晶，通過(guò)衍射數(shù)據(jù)，得到蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件苛刻，而且不是所有的蛋白質(zhì)都能變成單晶。但是利用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，可以對(duì)已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)做出預(yù)測(cè)，同時(shí)還能對(duì)蛋白質(zhì)序列中的每個(gè)氨基酸逐個(gè)分析，即比較蛋白質(zhì)模建，又稱(chēng)為同源模建。該方法是目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法[4-6]。本研究將地鱉蟲(chóng)纖溶酶的蛋白質(zhì)序列提交到NCBI的自動(dòng)比較蛋白質(zhì)模建服務(wù)器Blast上，通過(guò)程序自動(dòng)確定了地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列活性中心與底物結(jié)合的部位（圖1），Biosun軟件模擬生成了地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)。利用GOLDKEY軟件，對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶全序列的等電點(diǎn)、親水性、柔性進(jìn)行分析，利用無(wú)模型比對(duì)時(shí)活性中心氨基酸殘基的性質(zhì)，進(jìn)一步闡明地鱉蟲(chóng)纖溶酶的纖溶機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維結(jié)構(gòu)模擬與評(píng)估

將地鱉蟲(chóng)纖溶酶蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入Biosun軟件，軟件自動(dòng)選取蛋白質(zhì)Tryp_SPc[cd00190]為模板，模擬目的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中a、b、c 3個(gè)球狀模型，分別對(duì)應(yīng)S178、H41、D85 3個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈（羥基、咪唑基、羧基），與胰蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)一致[7，8]。d、e、f 3個(gè)肽鍵鏈狀模型，分別對(duì)應(yīng)于地鱉蟲(chóng)纖溶酶的底物結(jié)合部位D172、S193、G195。由三維結(jié)構(gòu)可以看出，底物結(jié)合部位和酶催化活性中心都沒(méi)有α螺旋和β折疊（α螺旋為柱狀區(qū)，β折疊為板狀區(qū)），該區(qū)域容易發(fā)生形變，在催化過(guò)程中跟底物結(jié)合時(shí)產(chǎn)生誘導(dǎo)契合，符合酶催化理論。酶活中心處于這個(gè)蛋白質(zhì)中心的凹穴處，與通常對(duì)纖溶酶活性中心的認(rèn)識(shí)一致[9，10]。筆者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，推測(cè)其為絲氨酸蛋白酶[1，2]，此推測(cè)與生物信息學(xué)方法找到的活性中心S178結(jié)論一致。

對(duì)模板蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比對(duì)（圖3），Blast軟件給出89.9的評(píng)分，說(shuō)明模板蛋白和地鱉蟲(chóng)纖溶酶的同源性比較高，二者序列覆蓋率達(dá)到99%。隨機(jī)匹配的可能性為2×10-19，這么小的隨機(jī)匹配可能性，說(shuō)明2個(gè)蛋白質(zhì)相同的序列部分，不是偶然出現(xiàn)的，是具有同源性的。二者最大序列的相似度達(dá)到43%。以此模板蛋白質(zhì)進(jìn)行同源模建，結(jié)果可信。

2.2 GOLDKEY軟件的序列分析

在地鱉蟲(chóng)纖溶酶三維結(jié)構(gòu)分析中，采用的是同源模建的方法。在預(yù)測(cè)的時(shí)候，其他蛋白質(zhì)與目標(biāo)預(yù)測(cè)物的差異會(huì)導(dǎo)致一定程度的偏差。采用GOLDKEY軟件對(duì)序列的每個(gè)殘基逐個(gè)計(jì)算其特性，雖然無(wú)法得到三維結(jié)構(gòu)，但是其數(shù)據(jù)可靠性更好，更能反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性。圖4為利用GOLDKEY軟件對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列的等電點(diǎn)進(jìn)行模擬。由圖4可知，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為9.67。在通常生理環(huán)境下，該蛋白質(zhì)帶正電。纖維蛋白通常帶負(fù)電荷，所以地鱉蟲(chóng)纖溶酶很容易靠近纖維蛋白質(zhì)，與之結(jié)合，表明該酶對(duì)血栓有一定的靶向作用。

利用GOLDKEY軟件對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列進(jìn)行親水性模擬（圖5）。由圖5可知，地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列中每個(gè)氨基酸的親水值越大，親水性越強(qiáng)。其中H41為0.5，D85、S178、D172、S193、G195均為0。H41、D85、S178為活性部位，D172、S193、G195為底物結(jié)合部位，其親水值均比較低。在序列中，這6個(gè)殘基的親水值都處于局部最低點(diǎn)（相鄰殘基的親水值均較高）。對(duì)于水溶性球形蛋白質(zhì)，親水值較低的氨基酸趨向于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水值較高的氨基酸趨向于蛋白質(zhì)的外部，從一級(jí)結(jié)構(gòu)上的親水性推測(cè)，H41、D85、S178、D172、S193、G195這6個(gè)氨基酸都位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，與三級(jí)結(jié)構(gòu)相符。

利用GOLDKEY軟件對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列進(jìn)行柔性模擬（圖6）。由圖6可知，地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列中每個(gè)氨基酸的柔性值，其中H41=0.91，D85=0.93，S178=1.12， D172=1.03，S193=0.93，G195=0.93。H41、D85、S178為活性部位，D172、S193、G195為底物結(jié)合部位，其柔性值均比較大，符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)契合理論。在結(jié)合底物時(shí)，活性中心的結(jié)構(gòu)和底物的結(jié)構(gòu)都發(fā)生了一定的形變（柔性才能形變），使其在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)，從而能很好的契合。但是從全序列柔性值來(lái)看，催化中心和底物結(jié)合部位的柔性并非最大，而且催化中心和底物結(jié)合部位的柔性還處于局部最低點(diǎn)，都在峰谷處。這正好驗(yàn)證了酶結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性。酶具有高效性和專(zhuān)一性的催化特點(diǎn)，決定這些特點(diǎn)的關(guān)鍵不僅僅是因?yàn)槊富钚灾行牡年P(guān)鍵基團(tuán)，也與酶的特殊空間結(jié)構(gòu)有著不可分割的關(guān)系。所以酶關(guān)鍵部位的空間結(jié)構(gòu)也不能有太大的柔性，更不能隨意變形。

2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^(guò)程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈都有一個(gè)較長(zhǎng)的烷烴部分，疏水性較強(qiáng)，能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū)，而且長(zhǎng)鏈烷烴的一端含有1個(gè)氨基，能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)幾乎相同（約為5～6個(gè)σ C-C單鍵長(zhǎng)度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結(jié)構(gòu)上可知，D85與 D172相距約5個(gè)肽鍵長(zhǎng)度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度相同），這時(shí)酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12]，能協(xié)助肽鍵斷裂時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結(jié)

本研究對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，并對(duì)其全序列進(jìn)行分析。地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作于與精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

參考文獻(xiàn)：

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2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^(guò)程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈都有一個(gè)較長(zhǎng)的烷烴部分，疏水性較強(qiáng)，能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū)，而且長(zhǎng)鏈烷烴的一端含有1個(gè)氨基，能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)幾乎相同（約為5～6個(gè)σ C-C單鍵長(zhǎng)度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結(jié)構(gòu)上可知，D85與 D172相距約5個(gè)肽鍵長(zhǎng)度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度相同），這時(shí)酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12]，能協(xié)助肽鍵斷裂時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結(jié)

本研究對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，并對(duì)其全序列進(jìn)行分析。地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作于與精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^(guò)程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈都有一個(gè)較長(zhǎng)的烷烴部分，疏水性較強(qiáng)，能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū)，而且長(zhǎng)鏈烷烴的一端含有1個(gè)氨基，能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)幾乎相同（約為5～6個(gè)σ C-C單鍵長(zhǎng)度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結(jié)構(gòu)上可知，D85與 D172相距約5個(gè)肽鍵長(zhǎng)度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度相同），這時(shí)酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12]，能協(xié)助肽鍵斷裂時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結(jié)

本研究對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，并對(duì)其全序列進(jìn)行分析。地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作于與精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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