結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性白細(xì)胞介素—22在結(jié)核性胸膜炎鑒別診斷中的應(yīng)用

原艷明等

[摘 要] 目的：研究胸液單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原肽刺激后表達(dá)的白細(xì)胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）濃度測(cè)定在結(jié)核性與惡性胸腔積液鑒別診斷中的價(jià)值。方法：將確診的52例結(jié)核性胸膜炎和35例惡性胸腔積液患者胸液單個(gè)核細(xì)胞分離后，使用結(jié)核分枝桿菌特異抗原肽（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激培養(yǎng)，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-22和干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）濃度，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：結(jié)核性胸膜炎組IL-22濃度明顯高于惡性胸液組（P<0.01）。ROC曲線顯示IL-22用于結(jié)核性胸膜炎的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為90.38%、80.56%和85.23%，其診斷效能與IFN-γ相當(dāng)（P>0.05）。結(jié)論：結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性IL-22測(cè)定可作為對(duì)結(jié)核性胸膜炎診斷的重要參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 白細(xì)胞介素-22；結(jié)核性胸膜炎；惡性胸水；鑒別診斷

中圖分類號(hào)：R521.7 R446.62 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2014）03-001-03

[Abstract] Objective：To research the diagnosis value of the measurement of the concentration of Interleukin-22（IL-22）generated by the pleural fluid mononuclear cells（PFMCs）stimulated by specific MTB antigen peptides in tuberculous Pleurisy effusions（TPE）and malignant pleural effusions（MPE）. Methods： The pleural fluid mononuclear cells（PFMCs）of 52 cases of TPE and 35 cases of MPE were separated and cultivated with the stimulation of specific MTB antigen peptides（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）， the concentration of IL-22 and Interferon-γ（IFN-γ）of the PFMCs culture fluid supernatant were measured and the results were statistically analyzed. Results：The concentration of IL-22 in TPE group was significantly higher than MPE group（P<0.01）.ROC curve showed the sensibility 、specificity and the accuracy of IL-22 were 90.38%、80.56% and 85.23% when used in the diagnosis of TPE， the diagnose efficiency was equal to IFN-γ（P>0.05）. Conclusion： The measurement of the Mtb-antigen-specific IL-22 can be regarded as an important reference index in the diagnosis of TPE.

[Key words] Interleukin-22；Tuberculous pleurisy；Malignant pleural effusions；differential diagnosis

胸腔積液是臨床常見病癥，早期確診難度較大，目前仍依賴于特異性病原體的檢出或胸膜活檢發(fā)現(xiàn)典型病理改變。但由于檢出陽性率低，影響了患者獲得及時(shí)有效的診斷和治療。因此探尋靈敏度、特異度均好的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)臨床意義重大。本文通過測(cè)定87例確診的胸腔積液患者胸液單個(gè)核細(xì)胞（pleural fluid mononuclear cells，PFMCs）表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性白細(xì)胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）的濃度，與已廣泛應(yīng)用于臨床的干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）作比較，探索其在結(jié)核性胸膜炎與惡性胸水鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇解放軍309醫(yī)院2012年4月至2013年9月期間住院確診的胸腔積液患者。結(jié)核性胸膜炎組（結(jié)核組）患者52例，男34例，女18例，年齡17～76歲，平均（36±17）歲。診斷依據(jù)：1）胸液或胸膜活組織中抗酸桿菌陽性（涂片、培養(yǎng)或TB-DNA檢測(cè)）；2）胸膜活檢發(fā)現(xiàn)典型結(jié)核病變?nèi)缃Y(jié)核性肉芽腫或干酪樣壞死物改變；3）典型臨床表現(xiàn)、PPD皮試陽性、滲出性胸腔積液改變、外周血淋巴細(xì)胞干擾素釋放檢測(cè)及抗結(jié)核治療有效。惡性胸腔積液組（惡性組）35例，男15例，女20例，年齡36～82歲，平均（59.9±13.7）歲。診斷依據(jù)：胸膜活檢發(fā)現(xiàn)惡性病變和/或胸液脫落細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理 所有入組患者均在治療前，無菌操作下常規(guī)胸穿留取胸液50 mL，1800 rpm/min離心5 min，將沉淀細(xì)胞用Ficoll進(jìn)行密度梯度離心，獲取PFMCs，充分洗滌后，用RPM1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，部分200 ?L體系細(xì)胞懸液內(nèi)加入結(jié)核分枝桿菌（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）抗原肽庫（終濃度為40 ?g/mL），于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)18 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，- 80℃保存待測(cè)。1周內(nèi)完成樣品檢測(cè)。

結(jié)核分枝桿菌特異性抗原肽庫（ESAT-6，CFP-10）由北京賽百盛公司合成，純度大于95%。Ficoll密度梯度淋巴細(xì)胞分離液購自GE biosciences（USA），RPMI 1640培養(yǎng)液購自GIBCO（USA），細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購自eBioscience；流式細(xì)胞儀為Beckman coulter PC500型。

1.2.2 IL-22和IFN-γ濃度測(cè)定 使用Flowcytomix 流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品。根據(jù)eBioscience細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說明書操作，設(shè)陰性對(duì)照孔，主要步驟如下：將標(biāo)準(zhǔn)品、微球、生物素偶聯(lián)的檢測(cè)抗體按比例配置順次加入，避光室溫孵育2 h；清洗后按照FlowCytomix Pro 2.1分析軟件（eBioscience公司提供）計(jì)算比例加入鏈親和素-PE，避光室溫孵育1 h，再次清洗后進(jìn)行流式檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)品控制組間變異，組間變異小于15%。使用FlowCytomix Pro 2.1 分析軟件讀取所得流式檢測(cè)原始LMD文件，建立各檢測(cè)因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，軟件自動(dòng)計(jì)算出樣品濃度，結(jié)果以pg/mL表示。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位間距）表示。組間比較用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，應(yīng)用受試者工作特征曲線（ receiver operating2 characteristic curve，ROC），以Youdens指數(shù)最大的截?cái)帱c(diǎn)為診斷結(jié)核性胸膜炎的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算IL-22的診斷效能，率的比較用x2檢驗(yàn)。此次試驗(yàn)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件處理，以P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-22和IFN-γ測(cè)定結(jié)果

結(jié)核組PFMCs經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原肽庫刺激后產(chǎn)生的IL-22濃度[1161（3279.8）] pg/mL與培養(yǎng)液上清液比濃度顯著升高（P<0.01），與惡性組比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與IFN-γ檢測(cè)結(jié)果一致。見表1。

2.2 結(jié)核分枝桿菌抗原特異反應(yīng)性IL-22和IFN-γ對(duì)胸腔積液的鑒別診斷價(jià)值

以Youdens指數(shù)最大的截?cái)帱c(diǎn)為診斷結(jié)核性胸膜炎的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算IL-22和IFN-γ對(duì)結(jié)核性和惡性胸腔積液的鑒別診斷價(jià)值，表2可見兩組間差異（P>0.05）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

胸腔積液是臨床常見病癥，結(jié)核性胸膜炎和惡性胸膜疾病是主要病因[1]。由于涂片檢測(cè)抗酸桿菌陽性率不足5%，結(jié)核菌培養(yǎng)的診斷敏感性也只有58%[2，3]，確診并非易事。尋找敏感性和特異性較高的檢測(cè)指標(biāo)以輔助胸腔積液的病因診斷一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

IL-22是Th22細(xì)胞（helper T cell 22，Th22）的主要產(chǎn)物[4]，也可由Th1（helper T cell 1，Th1）、Th17（helper T cell 17，Th17）、NK細(xì)胞（natural killer cell，NK cell）等多種免疫細(xì)胞表達(dá)[5]。當(dāng)機(jī)體感染病毒或細(xì)菌等病原體后，IL-22能夠激活其它免疫細(xì)胞，幫助機(jī)體控制炎癥對(duì)抗感染[6]，并通過介導(dǎo)組織表達(dá)急性炎癥蛋白、粘蛋白或抗微生物肽等物質(zhì)，使慢性炎癥中的組織保持完整[7]。在結(jié)核免疫中，IL-22可通過促進(jìn)向自然殺傷細(xì)胞溶酶體傳送結(jié)核分枝桿菌，加強(qiáng)吞噬溶酶體的溶解作用[8]，并可能通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表達(dá)，參與結(jié)核性胸膜炎的免疫病理[9]。Qiao D等[10]證實(shí)在結(jié)核性胸腔積液中存在結(jié)核分枝桿菌特異的Th22細(xì)胞，使用（ESAT-6、CFP-10）抗原肽刺激后，IL-22 mRNA顯著上調(diào)，表達(dá)產(chǎn)物增加。

結(jié)核分枝桿菌抗原特異IFN-γ檢測(cè)目前已成為一種重要的診斷結(jié)核的生物標(biāo)記物。受到結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T細(xì)胞再次遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生特異性IFN-γ，特異性升高的IFN-γ量可以反映體內(nèi)結(jié)核特異性T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)弱，依此可間接判斷結(jié)核分枝桿菌的感染情況[11]。抗原ESAT6、CFP10是重要的T細(xì)胞抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生記憶性免疫應(yīng)答，是致病性MTB特有而BCG缺失的片段[12]，能夠區(qū)分真性結(jié)核感染，排除BCG接種產(chǎn)生的干擾。

本研究以IL-22為觀察指標(biāo)，使用結(jié)核分枝桿菌特異抗原肽（ESAT-6、CFP-10）刺激培養(yǎng)87例胸腔積液患者PFMCs，通過檢測(cè)培養(yǎng)液上清中IL-22的濃度，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)核組IL-22在刺激后上清中表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），與Qiao D研究結(jié)果一致，且結(jié)果明顯高于惡性組（P<0.05）。用于診斷結(jié)核性胸膜炎時(shí)，敏感性和特異性分別達(dá)到90.38%和80.56%，與IFN-γ診斷效能相當(dāng)。因此認(rèn)為，IL-22與IFN-γ類似，可作為結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)之外的一個(gè)非常有效的輔助診斷方法。

參 考 文 獻(xiàn)

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