RP—HPLC法測定阿魏酸衍生物的含量及其有關(guān)物質(zhì)

陳麗芳等

[摘 要] 目的：建立測定阿魏酸衍生物（BL）含量及其有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法。方法：采用Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m）色譜柱，流動相為甲醇-0.1%乙酸（42：58），流速1.0 mL·min-1；檢測波長228nm；進樣量20?L；柱溫：40℃。結(jié)果：在該條件下BL主峰與有關(guān)物質(zhì)得到很好的分離；檢測濃度在0.08～0.32mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r=0.9996）；檢測限和定量限分別為8ng和36ng。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，專屬性好，可用于BL含量及其有關(guān)物質(zhì)的測定。

[關(guān)鍵詞] 反相高效液相色譜法；阿魏酸衍生物；含量測定；有關(guān)物質(zhì)

中圖分類號：O657 R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2014）03-072-03

[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of ferulic acid derivative （BL） and its related substances. Methods： Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m） column was adopted；the mobile phase consisted of methanol-0.1% acetic acid （42：58） at the flow rate of 1.0 mL·min-1；The ultraviolet detection wavelength was set at 228nm；Loaded volume was 20?L；the column temperature was 40℃. Results： Using this method，BL and its related substances were well separated；The standard curve was rectilinear in the range of 0.08mg·mL-1～0.32 mg·mL-1 （ r=0.9996） ；The limit of detection and quantification were 8ng and 36ng. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content BL and its related substances.

[Key words] RP-HPLC；ferulic acid derivative；assay；related substances

阿魏酸衍生物（BL）是對阿魏酸（Ferulic Acid，4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）苯環(huán)進行改造后的化合物，是一個良好的抗氧化劑[1]。文獻[2]報道其清除自由基的能力比阿魏酸明顯增強。BL結(jié)構(gòu)中溴原子的引入[2]，不僅提高了清除自由基的能力，還明顯增大了脂溶性，這有利于其在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運與吸收。本文參照文獻[3-6]建立了反相高效液相色譜方法，用于測定BL含量及其有關(guān)物質(zhì)，為其質(zhì)量的可控奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

Waters 600-717-996高效液相色譜儀（二元泵，二極管陣列檢測器，自動進樣器，Millennium32色譜工作站）；電子分析天平（Sartorius，BP211D）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇（色譜純，禹王試劑）；乙酸（分析純，國藥集團）；水（娃哈哈純凈水）；30%H2O2（分析純，國藥集團）；鹽酸（分析純，國藥集團）；氫氧化鈉（純度：96.0%，西隴化工有限公司）；BL對照品（批號：20121101純度：99.91%，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供）；BL供試品（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，批號分別為20130201，20130202，20130203）。

2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m）色譜柱；流動相：甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V）；紫外檢測器檢測波長228nm；流速1.0mL·min-1；進樣量20?L；柱溫：40℃。理論塔板數(shù)以BL計算不低于5000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1（主峰保留時間：14.5min，雜質(zhì)1保留時間：5.8min，雜質(zhì)2保留時間：12.8min，雜質(zhì)3保留時間：38.8min）。

3 溶液的配制

3.1 對照品溶液

取BL對照品約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

3.2 供試品溶液

取BL供試品約10mg，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

4 方法專屬性考察

分別精密稱取BL供試品約20mg，置3個25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，進行如下破壞試驗：①酸破壞：加1mol·L-1鹽酸1mL，室溫下靜置17h，用1mol·L-1氫氧化鈉中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；②堿破壞：加1mol·L-1氫氧化鈉4mL，室溫下靜置65h，85℃水浴2.5h，冷卻至室溫，用1mol·L-1鹽酸中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；③氧化破壞：加30%雙氧水8mL，室溫下靜置62h，85℃水浴2.5h，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。endprint

按照“2”項下的色譜條件，分別取各破壞溶液20?L進樣，記錄色譜圖，見圖2。 通過破壞試驗可以看出BL 在堿、氧化條件下比較穩(wěn)定，放置期間有關(guān)物質(zhì)略有增加，在酸性條件下極不穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)增加明顯，但有關(guān)物質(zhì)均與主峰分離良好，不干擾樣品測定，說明該方法專屬性好。

5 方法學(xué)考察

5.1 線性關(guān)系考察

精密稱取BL對照品（批號：20121101）約4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶并稀釋成約0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度對照品溶液。分別取上述溶液20?L進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積A對濃度C（mg·mL-1）進行線性回歸，得回歸方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

5.2 儀器精密度試驗

取濃度為0.20mg/mL對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20?L，以峰面積計算，所得RSD為0.57%（n=6），表明測定時的儀器精密度良好。

5.3 重復(fù)性試驗

取同一批號的BL供試品按“3.2”項下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行配制3份，共9份，照“2”項下色譜條件測定，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品含量，測得平均含量為100.35%，RSD為0.50%（n=9），表明方法重復(fù)性良好。

5.4 穩(wěn)定性試驗

取室溫下放置的低、中、高3個濃度的供試品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的條件下，按照“2”項下色譜條件測定峰面積，測得RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

5.5 檢測限與定量限

精密吸取“3.1”項下對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，進樣，記錄色譜圖，在信噪比（S/N）為3：1時測得檢測限為8ng，在信噪比（S/N）為10：1時測得的定量限為36ng。

6 樣品含量測定

按“3”項下的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，各取20?L進樣，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品含量，結(jié)果表明，3批樣品含量均在99.0%以上（見表1）。

7 有關(guān)物質(zhì)測定

取BL供試品約20mg，精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.80mg/mL的溶液作為供試品溶液。精密移取此溶液適量，用甲醇稀釋100倍，得自身對照溶液。以不加校正因子主成分自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的含量[7]。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)均在1%以內(nèi)（見表1）。

8 討論

8.1 波長的選擇

取BL對照品溶液進行紫外掃描顯示其最大吸收波長在228nm和317nm處，其中228nm處的吸收值最高，因此選擇228nm用于BL的含量測定，保證測定時有較高的靈敏度。

8.2 柱溫的選擇

考察了25℃、30℃、40℃的不同柱溫下對樣品分離效果的影響，實驗表明，采用40℃的柱溫，可減小流動相粘度、降低柱壓、縮短出峰時間并改善分離效果，故將柱溫定為40℃。

8.3 流動相的選擇

根據(jù)BL的化學(xué)性質(zhì)，考慮采用酸性流動相可以獲得較好效果。經(jīng)過實驗比較采用甲醇-乙酸-水系統(tǒng)作為流動相，并且變換流動相比例和乙酸濃度，最終確定流動相為甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此條件下分離效果最好，保留時間適中。

8.4 穩(wěn)定性考察

由于BL的結(jié)構(gòu)特性，通常在溶液中不穩(wěn)定，且見光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BL溶液在透明量瓶放置8小時后含量顯著降低，而在棕色量瓶中的放置12小時含量變化不大，RSD小于2.0%，但是隨著時間增長含量仍會緩慢降低。故在試驗過程中需采取避光措施，并于配制后盡快使用。

8.5 結(jié)論

綜上所述，本方法操作簡便且檢測限、定量限、精密度、重復(fù)性等均符合要求，故本法適用于對BL含量及其有關(guān)物質(zhì)進行測定，對于BL的質(zhì)量控制和使用安全有著十分重要的意義。

參 考 文 獻

[1] 徐敬俠，張首國，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化學(xué)試劑，2012，34（5） ：463-466.

[2] 黃華永，張魯勉，鄭錦鴻.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，18（3） ： 129-131.

[3] 李全斌，何開勇，吳建萍.阿魏酸含量測定方法研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，17（3）： 117-119.

[4] 黃羅生，郭健新，劉詠梅，等.HPLC測定阿魏酸含量的探討[J].中成藥，2004，26（2）： 134-136.

[5] 何玲玲.高效液相色譜法測定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（3）： 60-62.

[6] 顧民，張亮，張正行.HPLC測定逍遙散及當(dāng)歸中阿魏酸的含量[J].中成藥，2000，22（5）： 342-344.

[7] ChP（中國藥典）.2010.VolⅡ（二部）：Appendix （附錄）V D

[8] 夏明，董曉燁.當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸的含量測定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（1）：103-104.

[9] 馬宏達，李陽，趙慶春，等.高效液相色譜法測定天寧顆粒中阿魏酸含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31（7）：918-920.endprint

按照“2”項下的色譜條件，分別取各破壞溶液20?L進樣，記錄色譜圖，見圖2。 通過破壞試驗可以看出BL 在堿、氧化條件下比較穩(wěn)定，放置期間有關(guān)物質(zhì)略有增加，在酸性條件下極不穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)增加明顯，但有關(guān)物質(zhì)均與主峰分離良好，不干擾樣品測定，說明該方法專屬性好。

5 方法學(xué)考察

5.1 線性關(guān)系考察

精密稱取BL對照品（批號：20121101）約4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶并稀釋成約0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度對照品溶液。分別取上述溶液20?L進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積A對濃度C（mg·mL-1）進行線性回歸，得回歸方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

5.2 儀器精密度試驗

取濃度為0.20mg/mL對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20?L，以峰面積計算，所得RSD為0.57%（n=6），表明測定時的儀器精密度良好。

5.3 重復(fù)性試驗

取同一批號的BL供試品按“3.2”項下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行配制3份，共9份，照“2”項下色譜條件測定，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品含量，測得平均含量為100.35%，RSD為0.50%（n=9），表明方法重復(fù)性良好。

5.4 穩(wěn)定性試驗

取室溫下放置的低、中、高3個濃度的供試品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的條件下，按照“2”項下色譜條件測定峰面積，測得RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

5.5 檢測限與定量限

精密吸取“3.1”項下對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，進樣，記錄色譜圖，在信噪比（S/N）為3：1時測得檢測限為8ng，在信噪比（S/N）為10：1時測得的定量限為36ng。

6 樣品含量測定

按“3”項下的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，各取20?L進樣，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品含量，結(jié)果表明，3批樣品含量均在99.0%以上（見表1）。

7 有關(guān)物質(zhì)測定

取BL供試品約20mg，精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.80mg/mL的溶液作為供試品溶液。精密移取此溶液適量，用甲醇稀釋100倍，得自身對照溶液。以不加校正因子主成分自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的含量[7]。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)均在1%以內(nèi)（見表1）。

8 討論

8.1 波長的選擇

取BL對照品溶液進行紫外掃描顯示其最大吸收波長在228nm和317nm處，其中228nm處的吸收值最高，因此選擇228nm用于BL的含量測定，保證測定時有較高的靈敏度。

8.2 柱溫的選擇

考察了25℃、30℃、40℃的不同柱溫下對樣品分離效果的影響，實驗表明，采用40℃的柱溫，可減小流動相粘度、降低柱壓、縮短出峰時間并改善分離效果，故將柱溫定為40℃。

8.3 流動相的選擇

根據(jù)BL的化學(xué)性質(zhì)，考慮采用酸性流動相可以獲得較好效果。經(jīng)過實驗比較采用甲醇-乙酸-水系統(tǒng)作為流動相，并且變換流動相比例和乙酸濃度，最終確定流動相為甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此條件下分離效果最好，保留時間適中。

8.4 穩(wěn)定性考察

由于BL的結(jié)構(gòu)特性，通常在溶液中不穩(wěn)定，且見光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BL溶液在透明量瓶放置8小時后含量顯著降低，而在棕色量瓶中的放置12小時含量變化不大，RSD小于2.0%，但是隨著時間增長含量仍會緩慢降低。故在試驗過程中需采取避光措施，并于配制后盡快使用。

8.5 結(jié)論

綜上所述，本方法操作簡便且檢測限、定量限、精密度、重復(fù)性等均符合要求，故本法適用于對BL含量及其有關(guān)物質(zhì)進行測定，對于BL的質(zhì)量控制和使用安全有著十分重要的意義。

參 考 文 獻

[1] 徐敬俠，張首國，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化學(xué)試劑，2012，34（5） ：463-466.

[2] 黃華永，張魯勉，鄭錦鴻.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，18（3） ： 129-131.

[3] 李全斌，何開勇，吳建萍.阿魏酸含量測定方法研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，17（3）： 117-119.

[4] 黃羅生，郭健新，劉詠梅，等.HPLC測定阿魏酸含量的探討[J].中成藥，2004，26（2）： 134-136.

[5] 何玲玲.高效液相色譜法測定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（3）： 60-62.

[6] 顧民，張亮，張正行.HPLC測定逍遙散及當(dāng)歸中阿魏酸的含量[J].中成藥，2000，22（5）： 342-344.

[7] ChP（中國藥典）.2010.VolⅡ（二部）：Appendix （附錄）V D

[8] 夏明，董曉燁.當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸的含量測定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（1）：103-104.

[9] 馬宏達，李陽，趙慶春，等.高效液相色譜法測定天寧顆粒中阿魏酸含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31（7）：918-920.endprint

按照“2”項下的色譜條件，分別取各破壞溶液20?L進樣，記錄色譜圖，見圖2。 通過破壞試驗可以看出BL 在堿、氧化條件下比較穩(wěn)定，放置期間有關(guān)物質(zhì)略有增加，在酸性條件下極不穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)增加明顯，但有關(guān)物質(zhì)均與主峰分離良好，不干擾樣品測定，說明該方法專屬性好。

5 方法學(xué)考察

5.1 線性關(guān)系考察

精密稱取BL對照品（批號：20121101）約4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲助溶并稀釋成約0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度對照品溶液。分別取上述溶液20?L進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積A對濃度C（mg·mL-1）進行線性回歸，得回歸方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

5.2 儀器精密度試驗

取濃度為0.20mg/mL對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20?L，以峰面積計算，所得RSD為0.57%（n=6），表明測定時的儀器精密度良好。

5.3 重復(fù)性試驗

取同一批號的BL供試品按“3.2”項下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行配制3份，共9份，照“2”項下色譜條件測定，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品含量，測得平均含量為100.35%，RSD為0.50%（n=9），表明方法重復(fù)性良好。

5.4 穩(wěn)定性試驗

取室溫下放置的低、中、高3個濃度的供試品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的條件下，按照“2”項下色譜條件測定峰面積，測得RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

5.5 檢測限與定量限

精密吸取“3.1”項下對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，進樣，記錄色譜圖，在信噪比（S/N）為3：1時測得檢測限為8ng，在信噪比（S/N）為10：1時測得的定量限為36ng。

6 樣品含量測定

按“3”項下的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，各取20?L進樣，按外標(biāo)法以峰面積計算樣品含量，結(jié)果表明，3批樣品含量均在99.0%以上（見表1）。

7 有關(guān)物質(zhì)測定

取BL供試品約20mg，精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.80mg/mL的溶液作為供試品溶液。精密移取此溶液適量，用甲醇稀釋100倍，得自身對照溶液。以不加校正因子主成分自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的含量[7]。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)均在1%以內(nèi)（見表1）。

8 討論

8.1 波長的選擇

取BL對照品溶液進行紫外掃描顯示其最大吸收波長在228nm和317nm處，其中228nm處的吸收值最高，因此選擇228nm用于BL的含量測定，保證測定時有較高的靈敏度。

8.2 柱溫的選擇

考察了25℃、30℃、40℃的不同柱溫下對樣品分離效果的影響，實驗表明，采用40℃的柱溫，可減小流動相粘度、降低柱壓、縮短出峰時間并改善分離效果，故將柱溫定為40℃。

8.3 流動相的選擇

根據(jù)BL的化學(xué)性質(zhì)，考慮采用酸性流動相可以獲得較好效果。經(jīng)過實驗比較采用甲醇-乙酸-水系統(tǒng)作為流動相，并且變換流動相比例和乙酸濃度，最終確定流動相為甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此條件下分離效果最好，保留時間適中。

8.4 穩(wěn)定性考察

由于BL的結(jié)構(gòu)特性，通常在溶液中不穩(wěn)定，且見光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)BL溶液在透明量瓶放置8小時后含量顯著降低，而在棕色量瓶中的放置12小時含量變化不大，RSD小于2.0%，但是隨著時間增長含量仍會緩慢降低。故在試驗過程中需采取避光措施，并于配制后盡快使用。

8.5 結(jié)論

綜上所述，本方法操作簡便且檢測限、定量限、精密度、重復(fù)性等均符合要求，故本法適用于對BL含量及其有關(guān)物質(zhì)進行測定，對于BL的質(zhì)量控制和使用安全有著十分重要的意義。

參 考 文 獻

[1] 徐敬俠，張首國，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化學(xué)試劑，2012，34（5） ：463-466.

[2] 黃華永，張魯勉，鄭錦鴻.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，18（3） ： 129-131.

[3] 李全斌，何開勇，吳建萍.阿魏酸含量測定方法研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，17（3）： 117-119.

[4] 黃羅生，郭健新，劉詠梅，等.HPLC測定阿魏酸含量的探討[J].中成藥，2004，26（2）： 134-136.

[5] 何玲玲.高效液相色譜法測定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（3）： 60-62.

[6] 顧民，張亮，張正行.HPLC測定逍遙散及當(dāng)歸中阿魏酸的含量[J].中成藥，2000，22（5）： 342-344.

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