姜黃素對鎘引導(dǎo)的小鼠肝臟損傷的保護作用

王 蘭， 金 賽， 龔 頻， 道祖佑， 白曉換， 陳福欣

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021, China; 2.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054)

0 引言

姜黃素是一種由姜科植物姜黃中所提取到的天然色素，大量的研究表明姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、清除自由基等作用[1].姜黃素具有明顯的抗氧化作用，源于其結(jié)構(gòu)中的酚羥基和B-二酮中間的亞甲基可以提供質(zhì)子阻斷自由基反應(yīng), 是主要的抗氧化活性基團，所以其具有優(yōu)異的清除自由基的能力[2-4].

鎘是一種人體非必需的重金屬，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中.生活中的鎘主要來自于食品、飲水及香煙燃燒.由于其長半衰期(6.2～18年)且低代謝率，鎘一旦進入體內(nèi)，主要蓄積在肝臟和腎臟中，損傷器官，造成機體功能的紊亂[5-7].

本研究通過構(gòu)建鎘誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型，測量氧化損傷指標：一氧化氮(NO)、蛋白羰基化(PCO)及抗氧化酶活性：過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)并結(jié)合元素分析，進一步研究姜黃素對鎘致小鼠肝臟損傷的保護作用及其可能機制，為姜黃素的臨床應(yīng)用及鎘損傷造成的氧化損傷提供一定的理論依據(jù).

1 材料

雄性昆明小鼠30只，購買自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，體重(20±2) g，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由取食飲水.姜黃素、甲基纖維素鈉購自廣州市紅星試劑廠，CdCl2購自天津市福晨化學(xué)試劑廠、N-(1-萘基)-乙二胺、30%過氧化氫購自天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠，對氨基苯磺酸購自阿達瑪斯公司，其它試劑均為分析純.

2 方法

2.1 動物模型的分組及構(gòu)建

昆明小鼠30只，分別隨機分為5組，每組6只，其中空白組腹腔注射生理鹽水，損傷組注射2 mg/(kg·d)的氯化鎘溶液，喂飼生理鹽水，保護組3組，分別喂飼為低、中、高不同濃度的姜黃素混懸液，腹腔注射氯化鎘溶液，所有小鼠均自由飲水，進食常規(guī)飼料如表1所示，飼養(yǎng)7 d，第八天斷頸處死，取出肝臟，一部分制備肝臟勻漿液，測定SOD、CAT、NO、PCO的含量.一部分冷凍保存，用于元素含量的測定.

表1 給藥方式及給藥劑量

2.2 樣品測定方法及指標

將肝臟樣品制備成10%的組織勻漿，考馬斯亮藍法測定蛋白，2，4-二硝基苯肼(DNPH) 法測定蛋白羰基化程度，聯(lián)苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，鉬酸銨顯色法測定過氧化氫酶(CAT) 活性，Griess反應(yīng)測定組織中NO含量.

2.3 元素含量檢測

準確稱取肝臟的重量，在馬弗爐中灰化，灰燼溶于8 mL的3 mol/LHNO3中，使用偏振塞曼原子吸收光譜，采用火焰法測定樣品中的Ca2+、Zn2+、Cd2+元素的含量為每克組織中含有ug元素(ug/g wet tissue).

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

平均值用單向方差分析法( one-way analysis of variance，ANOVA) 和相應(yīng)的t-檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析.p≥0.05具有顯著性差異.

3 結(jié)果與分析

3.1 姜黃素對鎘致的肝臟的損傷及姜黃素的保護作用

K為空白組，S為損傷組，A、B、C為由低到高的不同濃度姜黃素混懸液的保護組.

圖1 姜黃素對肝臟的的保護作用 及鎘的損傷一氧化氮的測定 與空白組相比，*P<0.05；和損傷組相比，#P<0.05

如圖1所示，在經(jīng)過7天2 mg/kg·d的氯化鎘給藥后，S組小鼠一氧化氮(NO)含量高于K(空白)組，說明鎘能夠引起小鼠機體一氧化氮含量的升高，而喂飼不同濃度的姜黃素混懸液，能夠顯著的降低機體內(nèi)一氧化氮的含量(P<0.05).

圖2 姜黃素保護作用及鎘損傷 腎臟蛋白羰基化檢測 與空白組相比，*P<0.05；和損傷組相比，#P<0.05

如圖2所示，在經(jīng)過7天2 mg/kg·d的氯化鎘給藥后,和空白組相比蛋白羰基化程度明顯高于空白組，鎘可以加速氨基酸側(cè)鏈氧化損傷成羰基，從而增加羰基產(chǎn)物的積累，而喂飼不同濃度的姜黃素混懸液，可以有效的減少氨基酸側(cè)鏈的氧化損傷.

圖3 姜黃素對肝臟的保護作用 及鎘的損傷過氧化氫酶的測定 與空白組相比，*P<0.05；和損傷組相比，#P<0.05

如圖3所示，在經(jīng)過7天2 mg/kg·d的氯化鎘給藥后，S組小鼠過氧化氫酶(CAT)含量低于空白組和保護組(P<0.05)，同時給予不同濃度的姜黃素(25、50、100 mg/kg·d)后，肝臟中過氧化氫酶的含量明顯升高(P<0.05).

圖4 姜黃素的保護作用及鎘的損傷 超氧化物歧化酶的含量 與空白組相比，*P<0.05；和損傷組相比，#P<0.05

如圖4所示，在經(jīng)過7天2 mg/kg·d的氯化鎘給藥后，S組小鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)的含量顯著減少，而SOD是一種清除超氧陰離子的重要的抗氧化酶，這種酶含量的減少，可以間接的說明，其抗氧化能力下降，而喂飼不同濃度的姜黃素混懸液后，對SOD含量下降有緩解作用(P<0.05).

3.2 元素分析結(jié)果檢測

如表2所示，在小鼠肝臟內(nèi)，損傷組的鎘的含量顯著增高(*P<0.05)，而喂飼姜黃素的保護組鎘的含量有所減少，說明姜黃素可以減少體內(nèi)鎘元素的肝臟的損傷，而鎘能夠降低小鼠肝臟內(nèi)鋅元素和銅元素的含量(*P<0.05，**P<0.01)，在姜黃素的影響下，鋅和銅元素的減少得到了有效的抑制.

表2 鎘的毒性對肝臟中金屬元素的影響及姜黃素的保護作用

與空白組相比*P<0.05，**P<0.01，和損傷相比#P<0.05

4 討論與結(jié)論

金屬鎘通過食物鏈進入機體,被機體吸收后，能在內(nèi)形成金屬硫蛋白，從而選擇性的蓄積于機體的各個器官，其中肝臟為主要器官之一. 研究結(jié)果表明，鎘損傷能夠?qū)е赂闻K金屬硫蛋白及金屬硫蛋白mRNA的含量增高且鎘損害肝臟細胞具有一定的濃度依賴性[8,9].實驗結(jié)果表明，鎘損傷可以改變抗氧化體系活性，間接誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，證實氧化壓力可能是鎘損傷小鼠肝臟的潛在機制之一.

姜黃素對由于自由基引發(fā)的肝臟氧化損傷具有顯著的保護作用,能有效的減輕小鼠肝臟炎性反應(yīng)，也對肝臟過氧化損傷具有明顯保護作用[10-12].本實驗采用姜黃素作為保護劑，給小鼠喂飼不同濃度的姜黃素混懸液，腹腔注射氯化鎘，一周之后，解刨小鼠，取肝臟，測定NO、PCO、CAT、SOD及元素檢測等指標，研究鎘引起的肝臟損傷的影響及姜黃素對鎘損傷小鼠肝臟的保護作用.

鎘的毒性作用能夠減少損傷組的鋅和銅的含量，而姜黃素給藥在一定程度上緩解鋅和銅含量的減少.鋅是機體內(nèi)一種重要的微量元素，也是一種抗氧化物質(zhì)，是許多抗氧化酶的重要組成部分， 有研究表明鋅能夠顯著的降低肝臟中SOD活性，增加MDA含量的增加，補充鋅能顯著性的減少內(nèi)源性MDA的生成[13].而給予小鼠姜黃素混懸液之后，鋅在機體內(nèi)的含量減少得到了顯著的抑制.Saari JT[12]喂飼缺銅飼料發(fā)現(xiàn)大鼠LPO( 呼出氣乙烷) 增強,肝Cu,Zn-SOD 和CAT 活性顯著下降,提示缺銅動物易受氧化損傷.張文清等[14]提出補充不同劑量Cu2+后，大鼠的生化、生理、病理學(xué)指標均有顯著的變化，肝細胞線粒體水腫、肝勻漿和微粒體MDA含量下降，且有構(gòu)效關(guān)系，提出Cu2+在體內(nèi)亦有抗氧化作用.在本實驗中，在喂飼了姜黃素混懸液之后，肝臟內(nèi)Cd2+的含量顯著低于損傷組、而在姜黃素的保護下，能夠有效地抑制Zn2+和Cu2+的降低[15].

通過以上研究結(jié)果，姜黃素能夠有效的抑制由于鎘損傷引起的氧化損傷酶NO、MDA含量的增加，緩解抗氧化酶SOD、CAT活性的降低，姜黃素還有效的抑制了抗氧化物質(zhì)Zn2+和Cu2+含量的流失，表明，姜黃素能夠?qū)τ捎阪k損傷的小鼠肝臟起到保護作用，為進一步研究姜黃素的抗氧化作用提供了一些理論基礎(chǔ).

[1]羅廷順，李洪文，劉正文，等.姜黃素的提取分離與藥理作用研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2011,26(2)：102-107.

[2]吳 斌，李湘洲，楊國恩，等.姜黃色素的抗氧化性能和抗氧化機理研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009,21(1):121-123.

[3]王 威.常用天然色素抗氧活性的研究[J].食品科學(xué)，2003,24(6):96-100.

[4]狄建斌，顧振綸，趙笑東，等.姜黃素的抗氧化和抗炎作用研究進展[J].中草藥,2010,5(5):18-21.

[5]謝黎虹，許梓榮.重金屬鎘對動物及人類的毒性研究進展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003,15(6):376-381.

[6]劉振玉.谷胱甘肽的研究與應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，1995，15(1)：19-21.

[7]王 石.吸煙相關(guān)劑量鎘致大鼠肝臟損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].吉林：吉林大學(xué)，2010.

[8]楊建全，倪 慧，王玲玲，等.鎘損傷肝細胞體外模型建立[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013,22(3):243-245.

[9]任緒義，周 雍，張建鵬，等.鎘中毒大鼠睪丸與肝臟金屬硫蛋白表達的相時性研究[J].2002,29(5):812-814.

[10]楊東霞.姜黃素對幼兔血漿、肝臟部分生理指標的影響[J].遼寧學(xué)院學(xué)報，2006,13(6):50-51.

[11]石庚生.姜黃素對膿毒癥小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的抑制作用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011,27(18):2 721-2 722.

[12]陳 華，薛常鎬，陳鐵輝，等.姜黃及姜黃素對微囊藻粗毒素致急性肝損傷的化學(xué)預(yù)防作用[J].中國藥理學(xué)通報，2005,21(12):1 517-1 519.

[13]Bray T M,Bettger W J.The physiological role of zinc as an antioxidant[J].Free Radic.Biol.Med., 1990(8):281- 291.

[14]saari J T.Ethane production in copper-defieientrats[J].Proc.Soc.ExP.Biol.Med.,1990,195(1):30-33.

[15]張文清，海春旭，龔書明，等.銅對大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].中國環(huán)境科學(xué)，1994,14(1):13-16.