一步重組法構(gòu)建產(chǎn)龍膽苦苷酵母重組菌的研究

錢衛(wèi)東， 趙德志， 付云芳，陳雪峰， 毛培宏，周穎欣， 常 凱, 謝海艷

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 離子束生物技術(shù)中心， 新疆 烏魯木齊 830046)

0 引言

龍膽苦苷(Gentiopicroside)，別名龍膽苦甙，分子式為C16H20O9，分子量為356.11，為裂環(huán)環(huán)烯萜苷類化合物，屬于倍半萜類物質(zhì)，是藥用植物秦艽(Gentianamacrophylla)的主要藥用成分[1].近年來的研究表明，龍膽苦苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、健胃抗?jié)兊茸饔?，如作為國家一類新藥注射用秦龍苦素，為秦艽提取物龍膽苦苷的凍干粉針，用于黃疸型病毒性肝炎的治療[2-4].隨著人們對龍膽苦苷藥用價值的肯定，開發(fā)和生產(chǎn)以龍膽苦苷為原料的藥品越來越多，使得臨床上對龍膽苦苷的需求量日益增加.

龍膽苦苷多來源于龍膽科多年生草本植物秦艽.值得注意的是，秦艽藥材由于使用范圍不斷擴大，市場需求量逐年增加，致使野生資源急劇下降，已被列入國家三級保護野生藥材[5].又因為秦艽存在適生地窄、栽培困難、生長周期長等問題，造成目前市場上秦艽資源短缺，供需矛盾非常突出.

與國外相比而言，國內(nèi)近年來對龍膽苦苷來源的研究相對較多.Tiwari和Zhang 等運用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaeteriumrhizogenes)誘導(dǎo)出秦艽毛狀根，但未篩選出產(chǎn)龍膽苦苷的毛狀根[6-7].齊香君等運用秦艽懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)龍膽苦苷，產(chǎn)量僅為0.242 mg/g[8].上述結(jié)果表明，利用毛狀根或懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)龍膽苦苷目前都未能獲得理想的結(jié)果.

因此，研究和開發(fā)秦艽新資源、解決龍膽苦苷來源短缺問題亟需尋求其它藥源途徑和新的研究方法.近年來，代謝工程因其在尋求新型藥源和藥源種質(zhì)改良方面具有獨特優(yōu)勢，已經(jīng)逐漸成為當今國際生藥學(xué)界的研究熱點之一[9-12].

目前，關(guān)于秦艽藥用成分龍膽苦苷的生物合成相關(guān)基因的研究報道較少.趙鵬等分離克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMGR)基因家族的兩條基因和G10H 基因家族的一條基因，但其僅對HMGR和G10H 基因進行了序列分析，而沒有利用基因敲除/遺傳互補方法在體內(nèi)進行功能鑒定.在龍膽苦苷生物合成基因尚未闡明前，亟需尋求新思路構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物工程菌.近年來，由我國學(xué)者自主開發(fā)的離子束介導(dǎo)藥用植物基因組總DNA轉(zhuǎn)化微生物、構(gòu)建產(chǎn)藥用植物天然藥用成分重組菌株的技術(shù)，為利用微生物合成龍膽苦苷提供了技術(shù)支持[13，14].

1 材料和方法

1.1 菌種

多形漢遜酵母(HansenulapolymorphaH.polymorpha) DL-1菌株(來源為ATCC No.26012).

1.2 培養(yǎng)基

(1)YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉15 g，pH 6.5.

(2)種子液培養(yǎng)基(g/L) ：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，pH 6.5.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)： 丙三醇15 g，(NH4)2SO415 g，K2HPO40.24 g，MgSO4·7H2O 1.8 g,CaCl20.28 g，NaCl 0.6 g，NaNO30.58 g，F(xiàn)eCl3SO4·6H2O 0.006 g，硫胺素鹽酸鹽0.004 g,微量元素母液1 mL.

其中，微量元素母液(mg/L):Na2MoO4·2H2O 484 mg，MnSO4·H2O 176 mg，KI 207.5，CuSO4·5H2O 40 mg,ZnSO4·7H2O 40 mg，pH為6.5.

1.3 主要試劑和儀器

龍膽苦苷標準品(美國Sigma公司)；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、CMC-Na、硅膠GF254、香草醛、醋酸鋰等(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Tris-Hcl、十二烷基硫酸鈉(SDS) 、EDTA 、Tris飽和酚等(拜爾迪公司).

臺式冷凍離心機(Sigma);高效液相色譜儀(美國Waters);Ddevic 1多功能離子注入機(IBB).

1.4 試驗方法

1.4.1 秦艽的基因組DNA的提取

秦艽新鮮葉片采自陜西省太白縣秦艽種植基地.取其新鮮葉片約5 g置于研缽中，用液氮冷凍研磨至粉末，加入3.5 mL、2%(質(zhì)量分數(shù))、65 ℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，輕輕搖勻后分裝在1.5 mL EP管中(約1 mL/管)，置于65 ℃的水浴鍋中溫育，每隔10 min輕搖一次，溫育40 min.取出后，冷卻2 min，加入0.5 mL氯仿-異戊醇(24∶1，v/v)，漩渦振蕩2 min，然后，10,000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至裝有600μL異丙醇的EP管中，將離心管上下輕輕搖動30 s，使異丙醇與水層充分混合.

10,000 r/min離心2 min后，去掉上清液，自然風干，然后加入720μL的75%乙醇及80μL 5 mol/L的醋酸鈉，輕輕搖勻；10,000 r/min離心1 min后，倒掉上清液，加入800μL 75%(體積分數(shù))的乙醇，輕輕搖勻后，10,000 r/min離心30 s后，倒掉上清液，將離心管自然風干；再加入50μL 0.5×TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37 ℃恒溫箱約15 h.置于-20 ℃保存、備用.

1.4.2 酵母菌膜的制備

取酵母菌母液100μL轉(zhuǎn)接到裝有2 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃，110 r/min培養(yǎng)16～18 h,取菌體用保護液(葡萄糖0.5%+可溶性淀粉0.5%)稀釋，采用血球計數(shù)板計數(shù)法確定稀釋倍數(shù)，稀釋至細胞濃度為1.0×106CFU/mL，并取0.1 mL菌體稀釋液將其均勻涂布于直徑90 mm的無菌平皿中央，用無菌風吹干制成菌膜.

1.4.3 最佳離子注入能量和劑量的探索

根據(jù)試驗需要，設(shè)置不同的離子注入能量與劑量的組合，進行多次重復(fù)試驗，探索最佳的離子注入?yún)?shù)，參數(shù)設(shè)計為：能量分別是a:30 keV；b:25 keV；c:20 keV，注入劑量(ions/cm2)如表1所示.

表1 試驗中N+注入劑量

將菌膜平皿置于離子注入機真空靶室中央進行N+注入,按照a、b、c的能量和表1中的低能離子注入劑量注入.注入結(jié)束后，立即將2 mL不含基因組的TE溶液迅速倒入注入過的菌膜平皿中，置于 37 ℃恒溫箱中溫育2 h；然后用無菌刮鏟將菌全部刮下，取0.1 mL菌液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h.對照菌株做同樣處理，計算存活率.以低能注入劑量為橫坐標，存活率為縱坐標，制備注入曲線，獲得最佳的離子注入能量和劑量.

1.4.4 構(gòu)建產(chǎn)龍膽苦苷工程菌株

(1)低能離子注入酵母

利用上述獲得的最佳低能離子注入能量和劑量進行注入.注入完畢后，立即將2 mL含有秦艽基因組的TE溶液迅速加入經(jīng)低能離子注入過的菌膜平皿中，經(jīng)TE浸泡、溫育、涂固體培養(yǎng)基，在 37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h.取出放入4 ℃冰箱，以備初篩.

(2)重組菌株的初篩

將YPD培養(yǎng)基上生長的單菌落接入裝有5 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，放入37 ℃，160 r/min搖床上培養(yǎng)90 h得發(fā)酵液，將發(fā)酵液7,000 r/min離心15 min，收集上清液用于發(fā)酵產(chǎn)物檢測.由于龍膽苦苷是環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，因此，主要采用Molish反應(yīng)、香草醛反應(yīng).其操作步驟如下：

①Molish反應(yīng).100 ℃下濃縮發(fā)酵液后，加入甲醇10 mL，過濾.取濾液3 mL放入干凈試管中，加入兩滴Molish試劑(10%的α-萘酚醇溶液)搖勻，然后沿試管壁緩慢加入約1 mL濃硫酸，靜置，觀察兩層液面交界處的顏色變化.

②香草醛反應(yīng).取樣品濃縮液1 mL加入試管中，再加入0.5 mL、5%(質(zhì)量分數(shù))的香草醛濃硫酸溶液，65 ℃水浴2 min,觀察溶液顏色變化.

(3)重組菌株的復(fù)篩

將初篩所得菌株接種于裝有200 mL YPD液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃，160 r/min，恒溫培養(yǎng)90 h后，7,000 r/min離心15 min，收集上清液80 ℃濃縮至40 mL，加入20 mL預(yù)冷丙酮萃取，萃取3次，將收集的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃下蒸干，然后加入5 mL甲醇溶解，獲得樣品溶液，用薄層層析法和高效液相色譜法對產(chǎn)物進行定性和定量分析.

①薄層層析法(TLC)定性檢測.將薄層層析用GF254硅膠板放入干燥箱，105 ℃活化30 min.用微量進樣器點樣，在展開劑氯仿-甲醇(4∶1v/v)中展開，結(jié)束后揮發(fā)干展開劑，在紫外燈下觀察，記錄斑點，并計算其Rf值.

②高效液相色譜法(HPLC)定量檢測.色譜條件：色譜柱,Diamonsil C18柱(4.6 ×250 mm，5μm)；流動相,乙腈：水(40∶60，V/V)；紫外檢測器,Waters 2487；檢測波長,274 nm；進樣量,20μL；流速,1.0 mL/min；柱溫,25 ℃.

1.4.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

將重組菌株依次劃線傳代培養(yǎng)8代，將各代菌株活化后,接種于裝有200 mL YPD培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進行搖瓶培養(yǎng)，160 r/min ，37 ℃，恒溫培養(yǎng)90 h后，經(jīng)離心、濃縮、萃取、蒸發(fā)、溶解，制備樣品溶液.對樣品溶液經(jīng)過HPLC進行定量檢測，比較產(chǎn)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳低能離子注入能量和劑量

分別在a、b、c三種能量下，按照表1中的N+注入劑量進行注入.注入后，立即在每個平皿中加入2 mL不含秦艽DNA的TE溶液，37 ℃溫育2 h，用無菌刮鏟刮下薄膜后，經(jīng)平板培養(yǎng)18 h計算存活率,其結(jié)果如表2所示.

試驗a各組經(jīng)平板培養(yǎng)后，除空白對照組外，都未長出菌落；試驗b平面培養(yǎng)后，除對照組菌落過多之外，其余各組菌落數(shù)均有不同程度地減少，且出現(xiàn)隨著劑量的增加菌落數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象；試驗c經(jīng)平面培養(yǎng)后，出現(xiàn)各組菌落數(shù)均有一定程度減少，但減少幅度較小.

產(chǎn)生上述結(jié)果的主要原因是：試驗a是由于能量過大在對DNA產(chǎn)生更大傷害的同時，對細胞壁及細胞質(zhì)的刻蝕過于嚴重，產(chǎn)生不可逆的損傷，導(dǎo)致細胞死亡.

試驗b當以能量為25 keV劑量較低時，注入N+只對細胞表面進行損傷和刻蝕，損傷程度低，易于修復(fù),因此，存活率較高.隨著注入劑量的增加，細胞表面刻蝕嚴重，離子損傷及細胞內(nèi)部產(chǎn)生大量自由基和軟射線等，致使存活率急劇下降；當注入劑量達到20×1015ions/cm2時,存活率下降到最低.隨著注入劑量的增加，可能激活細胞內(nèi)某個修復(fù)機制，導(dǎo)致存活率有小幅度回升，之后隨著離子注入劑量的增加存活率再一次下降(如圖1所示)，這一結(jié)論與毛培宏提出的離子注入與生物體的相互作用機理[15]一致.

試驗c由于能量低，離子對細胞表面損傷和刻蝕程度較輕，經(jīng)過細胞的自我修復(fù)，存活率隨著劑量的增加雖有一定程度地降低，但幅度較小.

表2 菌落存活數(shù)

經(jīng)過上述試驗確定，N+注入技術(shù)轉(zhuǎn)化H.polymorphaDL-1的最佳條件為：低能離子注入能量，25 keV；劑量，25×1015ions/cm2.10-3真空條件下，脈沖注入10 s，間隔10 s.

圖1 低能N+注入多形漢遜酵母的存活率曲線

2.2 初篩結(jié)果分析

在能量25 keV、注入劑量25×1015ions/cm2、10-3Pa真空條件下，注入后，加入2 mL含秦艽基因組的TE溶液浸泡.37 ℃溫育2 h，將刮下來的菌液接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，取單菌落活化后接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵產(chǎn)物采用Molish反應(yīng)、香草醛反應(yīng).

結(jié)果顯示：在2,000多株備選菌株中，有313株的發(fā)酵液在Molish反應(yīng)中有紫環(huán)產(chǎn)生；有173株的發(fā)酵液在香草醛反應(yīng)中試管底部出現(xiàn)棕色或紅色；同時在兩種顏色反應(yīng)中均有相應(yīng)顏色出現(xiàn)的僅有54株.在真空條件下未經(jīng)離子注入的酵母菌在導(dǎo)入秦艽基因組DNA的處理中，未獲得糖苷類或環(huán)烯醚萜類物質(zhì)陽性反應(yīng)的菌株.由此可說明，用低能N+介導(dǎo)將秦艽基因組導(dǎo)入酵母的方法初步認為是可行的，同時也說明了導(dǎo)入外源DNA大分子轉(zhuǎn)化的隨機性和重組菌株的遺傳多樣性.

2.3 復(fù)篩結(jié)果分析

經(jīng)過初篩獲得了54株備選菌株，通過發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮等，制備樣品溶液.取20 μL各樣品溶液在薄層層析展板上點樣、風干.在展開劑氯仿-甲醇(4∶1，V/V)中展開，結(jié)束后揮發(fā)干展開劑，在紫外燈下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株的發(fā)酵液斑點與龍膽苦苷的標準品在同一直線上，其Rf值完全相同，均為0.30(如圖2所示)，由此可以初步斷定，該菌株為目標重組菌.

取Rf值一致的樣品溶液0.5 mL，用0.45μm微孔濾膜過濾，以20μL的進樣量，25 ℃柱溫，270 nm波長，1 mL/min流速，進行高效液相色譜(HPLC)分析檢測.對出峰時間和峰面積進行記錄分析，其結(jié)果如圖3所示.重組菌株的發(fā)酵液在高效液相色譜中的出峰時間為12.377 min，與龍膽苦苷標準品的出峰時間12.370 min基本一致，而出發(fā)菌株的發(fā)酵液在該位置未出現(xiàn)峰.

由上述試驗結(jié)果分析，可以確定該重組菌株為目標菌株，即可以發(fā)酵生產(chǎn)龍膽苦苷的酵母重組菌株.

1：出發(fā)菌株的發(fā)酵液；2：龍膽苦苷標準品；3：重組菌株的發(fā)酵液圖2 菌株發(fā)酵液的薄層層析圖譜

(a) 龍膽苦苷標準品HPLC圖譜

(b) 重組菌株發(fā)酵液HPLC圖譜

(c) 出發(fā)菌株發(fā)酵液HPLC圖譜圖3 菌株發(fā)酵液的HPLC圖譜

2.4 產(chǎn)龍膽苦苷的重組菌株的傳代穩(wěn)定性試驗

將復(fù)篩篩選出的重組菌株活化后接入5 mL YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h，用甘油保藏菌種，同時傳代培養(yǎng)，斜面?zhèn)髦?代，分別對8代菌株進行活化、發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵產(chǎn)物進行高效液相色譜分析，比較產(chǎn)量.其結(jié)果如表3所示,各代產(chǎn)量略有變化，但整體基本保持不變.這說明該菌株傳代穩(wěn)定性較好.

表3 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗

3 結(jié)論

本試驗利用低能N+注入對多形漢遜酵母進行直接注入誘變，通過存活率繪制出劑量-效應(yīng)曲線，即“馬鞍型”曲線，獲得最佳低能離子注入能量和劑量.利用最佳的低能離子注入能量和劑量注入介導(dǎo)秦艽基因組隨機轉(zhuǎn)化酵母，經(jīng)Molish反應(yīng)和香草醛反應(yīng)對轉(zhuǎn)化子進行初篩，接著利用薄層層析法和高效液相色譜法等對初篩獲得的候選菌株進行復(fù)篩，再結(jié)合遺傳穩(wěn)定性試驗，獲得了1株遺傳穩(wěn)定能生物合成龍膽苦苷的酵母重組菌.

本試驗結(jié)果表明，利用低能離子注入技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物重組酵母菌株，具有如下優(yōu)點：即在事先不清楚天然產(chǎn)物生物合成途徑及其相關(guān)基因或無需克隆相關(guān)基因構(gòu)建重組質(zhì)粒的情況下，可以實現(xiàn)“一步”構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物的重組酵母菌，為天然產(chǎn)物新藥源的開發(fā)提供了新思路、新方法.另外，人們還可以利用“逆向思維”,將獲得的產(chǎn)天然產(chǎn)物酵母重組菌作為研究對象，依托操作簡便的酵母遺傳操作平臺，深入研究天然產(chǎn)物的生物合成途徑及其相關(guān)基因的功能.

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