殼聚糖絮凝法脫除大棗多糖蛋白質(zhì)的研究

楊 輝， 米 佳， 羅建華

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.懷來(lái)縣貴族莊園葡萄酒業(yè)有限公司，河北 懷來(lái) 075400)

0 引言

大棗為鼠李科植物棗的干燥成熟果實(shí)，是我國(guó)的主要特產(chǎn)果實(shí).現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大棗中含有豐富的糖類、脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，具有十分豐富的藥用價(jià)值[1-3].

大棗多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等作用[4-7]，其多樣的藥理作用使得大棗多糖有著廣泛的應(yīng)用前景.然而，目前提取的大棗粗多糖中多含有一定量的蛋白質(zhì)，這在一定程度上影響了大棗多糖的綜合應(yīng)用.而且傳統(tǒng)的脫蛋白方法，如sevag法、三氯乙酸法等，都引入大量有機(jī)溶劑，不僅操作復(fù)雜并且廢液處理困難[8-11].因此，尋找一種合適的脫蛋白方法對(duì)于大棗多糖的開發(fā)應(yīng)用是十分必要的.

殼聚糖是一類天然的陽(yáng)離子型高分子絮凝劑，其作為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、無(wú)毒性、可降解特性等.殼聚糖在溶液中為帶正電荷的聚電解質(zhì)，可利用電荷和大分子間的架橋作用，有效除去多糖中的蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)[12-14].本實(shí)驗(yàn)利用殼聚糖的絮凝作用，去除大棗多糖中的蛋白質(zhì)，優(yōu)化脫蛋白工藝，為大棗多糖的綜合利用提供了參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大棗(市售)，殼聚糖(濟(jì)南海得貝生物公司),葡萄糖(成都金山化學(xué)試劑有限公司),濃硫酸(北京化工廠),苯酚(天津市紅巖化學(xué)試劑廠),考馬斯亮藍(lán)G-250(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心),牛血清白蛋白(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司),磷酸(天津市天士力化學(xué)試劑有限公司),95%乙醇(天津市天士力化學(xué)試劑有限公司).

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(賽多利斯儀器有限公司),722型光柵分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(DK-S22型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-1型，上海亞榮儀器廠)，高速臺(tái)式離心機(jī)(GT10-1型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大棗多糖的提取

取一定質(zhì)量的大棗，采用水提醇沉法，以料液比為1∶6于90 ℃水浴破皮提取2 h，離心分離得大棗粗多糖提取液.所得提取液經(jīng)濃縮、醇沉、離心、干燥后得大棗粗多糖.

1.3.2 殼聚糖溶液的配置

精確稱取1.000 0 g殼聚糖溶于100 mL的1%(V/V)醋酸溶液中，配成1%的殼聚糖溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆颍苊?4 h備用.

1.3.3 殼聚糖絮凝法脫蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

將提取的大棗粗多糖按一定的比例以水復(fù)溶，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)方案，于大棗粗多糖水溶液中加入一定量的殼聚糖溶液，控制脫蛋白溫度、酸度和時(shí)間，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).離心過(guò)濾，獲取純化后大棗多糖復(fù)溶液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量和多糖含量.

選取四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案為：殼聚糖絮凝劑添加量選取0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、3.00 mg/mL、5.00 mg/mL和7.00 mg/mL；絮凝溫度設(shè)定30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃；大棗復(fù)溶液pH選取2、4、6、8和10；絮凝時(shí)間選定10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min和100 min.以大棗多糖蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率為考量指標(biāo).

1.3.4 殼聚糖絮凝法脫蛋白正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以絮凝劑添加量A、絮凝溫度B、絮凝時(shí)間C等為因素，每個(gè)因素取3水平，按L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1所示.

表1 殼聚糖脫除大棗多糖蛋白質(zhì)試驗(yàn)因素及水平

1.4 分析方法

1.4.1 多糖含量的測(cè)定方法[15]

多糖含量的測(cè)定，采用苯酚-硫酸法.以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，在490 nm處測(cè)定其吸光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=7.501 9x-0.020 7，R2=0.997 5

多糖損失率=(C1-C2)/C1×100

(1)

式中：C1—絮凝前大棗多糖含量；C2—絮凝后大棗多糖含量.

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法.以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，在595 nm處測(cè)定其吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=6.665 7x+0.009 5，R2=0.995 4.

蛋白質(zhì)脫除率=(M1-M2)/M1×100

(2)

式中：M1—絮凝前蛋白質(zhì)含量；M2—絮凝后蛋白質(zhì)含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖添加量對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響

圖1為殼聚糖添加量對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響.結(jié)果表明，當(dāng)殼聚糖從0.5 mg/mL增加到1 mg/mL時(shí)，蛋白脫除率有較大增長(zhǎng)，同時(shí)大棗多糖的損失率也隨之增加；當(dāng)在1～5 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，大棗多糖損失率的增長(zhǎng)率大于蛋白脫除率，蛋白脫除率變化較小，當(dāng)在5 mg/mL時(shí)大棗多糖損失率超過(guò)蛋白脫除率.這可能是因?yàn)楫?dāng)殼聚糖添加量較小時(shí)，其優(yōu)先與易于結(jié)合的蛋白質(zhì)作用，當(dāng)殼聚糖用量增加時(shí)其與蛋白質(zhì)作用達(dá)到飽和，這時(shí)過(guò)量殼聚糖與多糖作用而引起多糖較大損失.因此，綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率，選擇添加3 mg/mL的絮凝劑較為適宜.

圖1 絮凝劑添加量對(duì)大棗多糖蛋白脫除率 和多糖損失率的影響

2.2 絮凝溫度對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響

圖2為絮凝溫度對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響.由圖2看出，殼聚糖的絮凝溫度不宜過(guò)高.從生產(chǎn)節(jié)能角度分析，30 ℃較好;從絮凝速度分析，40 ℃～50 ℃絮凝溫度可以加強(qiáng)體系的熱運(yùn)動(dòng)，從而增大了殼聚糖絮凝劑與蛋白質(zhì)的碰撞幾率，縮短了絮凝時(shí)間，提高了絮凝效率.

2.3 pH對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響

圖3為pH對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響.結(jié)果表明，酸性環(huán)境有利于殼聚糖絮凝蛋白質(zhì)，蛋白脫除適宜pH為4，在此條件下，多糖損失較?。籶H>4條件下，蛋白質(zhì)脫除率直線下降，而多糖損失的影響呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)；在pH為6時(shí)，多糖損失達(dá)到最大.這是因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境中，殼聚糖分子可以較好地伸展和質(zhì)子化，有利于與蛋白質(zhì)發(fā)生電中和；而在堿性環(huán)境中，則分子舒展不開，質(zhì)子化能力減弱，對(duì)蛋白質(zhì)和多糖絮凝效果較差.由于大棗多糖復(fù)溶液的pH正好為4.3左右，因此，殼聚糖絮凝脫蛋白不必對(duì)大棗多糖溶液pH進(jìn)行調(diào)整.

圖2 絮凝溫度對(duì)大棗多糖蛋白脫除率 和多糖損失率的影響

圖3 絮凝pH對(duì)大棗多糖蛋白脫除率 和多糖損失率的影響

2.4 絮凝時(shí)間對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響

圖4為絮凝時(shí)間對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率的影響.圖4中結(jié)果表明，在10～30 min時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率增長(zhǎng)較快，當(dāng)絮凝超過(guò)30 min，蛋白質(zhì)脫除率基本不變，此時(shí)殼聚糖與蛋白質(zhì)之間已達(dá)到吸附平衡，再增加絮凝時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)絮凝效果基本沒(méi)有影響，反而會(huì)增加多糖損失.因此，綜合考慮各項(xiàng)因素，選擇殼聚糖絮凝時(shí)間為30 min.

圖4 絮凝時(shí)間對(duì)大棗多糖蛋白脫除率 和多糖損失率的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2和表3分別為殼聚糖絮凝脫除大棗多糖蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析和方差分析.綜合考慮大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率，采用綜合加權(quán)評(píng)分法，權(quán)重系數(shù)均為0.5.為了使得綜合評(píng)分越高代表蛋白脫除率高并且多糖損失率低，因此以蛋白脫除率和“100-多糖損失率”中最大的指標(biāo)定為100分，其它各試驗(yàn)號(hào)按下式評(píng)分：

綜合評(píng)分= 蛋白質(zhì)脫除率/68.17×100×0.5+(100-多糖損失率)/(100-31.18)×100×0.5

結(jié)果表明：殼聚糖法脫除大棗蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為A1B2C2.其中3個(gè)因素對(duì)大棗多糖蛋白脫除率和多糖損失率綜合評(píng)分的影響順序?yàn)锳>B>C，即殼聚糖添加量影響最大，其各水平間之有顯著性差異，其次是殼聚糖絮凝溫度，最后是殼聚糖絮凝時(shí)間.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

按殼聚糖添加量2 mg/mL，絮凝溫度為50 ℃，絮凝時(shí)間為30 min的最佳工藝進(jìn)行三組平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4所示.結(jié)果表明，在最佳脫蛋白工藝條件下，大棗多糖蛋白脫除率為66.32%，多糖損失率為34.10%，并且多糖顏色變淺，說(shuō)明殼聚糖在絮凝脫蛋白的同時(shí)，還具有一定的脫色效果.

表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

3 結(jié)論

(1)殼聚糖絮凝法脫除大棗多糖蛋白質(zhì)效果明顯，但同時(shí)大棗多糖有一定的損失.殼聚糖絮凝脫除大棗多糖蛋白的適宜條件為：殼聚糖添加量為2.0 mg/mL ，絮凝溫度為50 ℃，絮凝時(shí)間為30 min.此時(shí),大棗多糖蛋白脫除率為66.32%，多糖損失率為34.10%.

(2)殼聚糖法脫除大棗多糖蛋白質(zhì)最主要的影響因素是殼聚糖的用量.殼聚糖在絮凝除蛋白的同時(shí)，還具有一定的脫色作用.

[1]姚文華，尹卓容.大棗的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2006(2)：28-30.

[2]李進(jìn)偉，丁紹東，李蘋蘋，等.五種棗成分及功能研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30(7)：294-296.

[3]雷昌貴，陳錦屏，盧大新.紅棗的營(yíng)養(yǎng)成分及其保健功能[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6(3)：56-57.

[4]羅 莉，玉崧成，王金水，等.大棗多糖結(jié)構(gòu)及藥理活性的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(30)：16 860-16 861.

[5]劉德義，孫 運(yùn)，顧有方，等.大棗多糖對(duì)小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2009，16(3)：202-203.

[6]顧有方，董策龍，陳會(huì)良，等.大棗多糖對(duì)大鼠血清自由基代謝的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2007，14(5)：347-348.

[7]李志州，陳均志.大棗多糖的抗氧化性研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28(4)：115-117.

[8]謝麗源，彭衛(wèi)紅，甘炳成.桑黃多糖脫蛋白方法與條件優(yōu)化[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24(1)：363-365.

[9]李知敏，王伯初，周 菁，等.植物多糖提取液的幾種脫蛋白方法的比較分析[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(8)：57-59.

[10]李 強(qiáng)，唐 微，鄭 偉，等.杜仲粗多糖脫蛋白方法的對(duì)比研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32(3)：316-317.

[11]張善玉.天然產(chǎn)物多糖脫蛋白方法的研究[J].中國(guó)藥房，2009，20(33)：2 633-2 635.

[12]祝連彩，王伯初．殼聚糖在中藥藥液澄清中的應(yīng)用[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(12)：55-57．

[13]趙靜虹，劉俊蘋，孫曉春，等.殼聚糖絮凝沉淀純化翅果油樹葉片多糖的方法探究[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，30(6)：639-643.

[14]廖春燕，黃 敏，黃 瑤，等.殼聚糖純化車前草水提液的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41(12)：123-126.

[15]楊 輝，閆明明.果膠酶提取大棗多糖的工藝研究[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，30(5)：62-66.