hCTR1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

陽 甜，李 洋，陳天君，高 雷，陳明偉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安 710061)

hCTR1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

陽 甜，李 洋，陳天君，高 雷，陳明偉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安 710061)

目的探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中hCTR1的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系以及減輕鉑類藥副反應(yīng)的臨床方法。方法采用免疫組織化學(xué)法，檢測54例手術(shù)后接受含順鉑方案一線化療的NSCLC患者組織中hCTR1的表達(dá)情況，其中35例患者于化療前后采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施，分析hCTR1表達(dá)與NSCLC患者臨床特征、病理類型、分化程度、臨床分期、化療療效及化療副反應(yīng)的關(guān)系。結(jié)果hCTR1的免疫陽性反應(yīng)主要定位于NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；hCTR1表達(dá)與含順鉑方案的化療療效及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P=0.02，P= 0.01)，而與年齡(P=0.29)、性別(P=0.32)、病理類型(P=0.19)、臨床分期(P=0.52)、分化程度(P=0.62)及是否吸煙(P=0.89)無關(guān)；化療副反應(yīng)大小與性別(P=0.87)及年齡(P=0.47)無關(guān)，與在化療前后是否采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施有關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論hCTR1的表達(dá)可能是NSCLC患者以鉑類為基礎(chǔ)治療的化療療效及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測因子。對于有高表達(dá)hCTR1的NSCLC患者化療時(shí)，在化療前后采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施，可以減輕化療副反應(yīng)。

非小細(xì)胞肺癌；銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(hCTR1)；順鉑；化療副反應(yīng)

據(jù)美國國家癌癥研究所報(bào)道腫瘤發(fā)生率及死亡率較前有所下降，但肺癌仍然是目前最常見的惡性腫瘤之一［1］。雖然隨著科技的發(fā)展及對肺癌的更多認(rèn)識，但是患者平均生存期仍然不容樂觀，早期診斷及治療仍然是全世界攻克的難題。鉑類藥作為一線化療藥，已被廣泛用于治療各種惡性腫瘤［2］，但繼發(fā)耐藥的發(fā)生，使肺癌患者生存期并沒有明顯提高。近年的研究發(fā)現(xiàn)，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族參與鉑類抗腫瘤藥物出胞和入胞的調(diào)節(jié)，攝入減少和泵出過多，均可減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的聚積，導(dǎo)致耐藥。銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(human copper transporters 1，hCTR1)是銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，是主要的銅離子攝入蛋白，研究證實(shí)其參與鉑類抗腫瘤藥物的攝入［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者h(yuǎn) CTR1表達(dá)與預(yù)后有關(guān)［4］。本研究通過免疫組化及生存分析方法，研究h CTR1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)，以尋求減輕鉑類耐藥的副反應(yīng)，減輕患者痛苦并指導(dǎo)臨床。

1 材料與方法

1.1 研究對象及治療所有標(biāo)本均來自2005年1月～2009年12月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科的石蠟包埋標(biāo)本54例，經(jīng)病理確診為肺癌，全部為初次經(jīng)過手術(shù)，術(shù)后進(jìn)行2周期以鉑類藥為基礎(chǔ)治療的化療，兩周期之間，間隔時(shí)間為3周，期間未進(jìn)行放療。其中35例患者于化療前后采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施減輕副反應(yīng)，另外19例患者化療前及出現(xiàn)明顯副反應(yīng)前未進(jìn)行上述治療?；煼椒橐痪€鉑類藥，鉑類藥劑量75～80 mg/m2。每周期化療結(jié)束，復(fù)查胸部CT、頭顱MRI、骨掃描及上腹部CT。按照RECIST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行化療療效評估。按照抗癌藥急性及亞急性毒性反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)(WHO標(biāo)準(zhǔn))評估副作用大小。

1.2 免疫組化SP方法檢測hCTR1及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)hCTR1購于美國Novus公司。符合條件的石蠟包埋切片54張，連續(xù)切片4張，4μm厚，60℃恒溫箱烤片過夜，脫蠟。消除內(nèi)源性過氧化物酶。EDTA熱修復(fù)自然冷卻至室溫后取出切片。PBS洗，3 min 3次，滴加一抗hCTR1(Novus 1∶250)，37℃放置2 h過夜。甩掉一抗，PBS洗，3 min 3次，擦干周圍液體，滴加二抗，室溫孵育30 min。甩掉二抗，PBS洗，3 min 3次，滴加DAB染液顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間。自來水沖洗后，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。

結(jié)果判定：按照HAO等［5］推薦的方法觀察h CTR1在NSCLC中的表達(dá)情況。評分采用染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合評價(jià)。染色強(qiáng)度評分：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。計(jì)數(shù)每個(gè)組織的3個(gè)10×40倍視野下腫瘤細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比=(陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞數(shù)/所有腫瘤細(xì)胞數(shù))×100%。評分：0分＜10%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～74%；4分，＞75%。兩類所得評分的乘積為最終結(jié)果：4～12分為高表達(dá)；小于4分為低表達(dá)。判讀標(biāo)準(zhǔn)：所有載玻片結(jié)果均由2名病理醫(yī)師在雙盲情況下對免疫組化染色進(jìn)行獨(dú)立閱片評估。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用卡方檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hCTR1在NSCLC中的表達(dá)hCTR1陽性染色主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，陽性產(chǎn)物呈棕黃色彌漫分布，在NSCLC中的表達(dá)強(qiáng)度及范圍如圖1所示。

圖1 hCTR1在NSCLC中的表達(dá)強(qiáng)度及范圍Fig.1 Intensity and range of hCTR1 expression in non-small cell lung cancer(×200)

2.2 hCTR1表達(dá)與NSCLC臨床及病理的關(guān)系hCTR1的表達(dá)54例中陽性表達(dá)率為59.2%。表達(dá)與年齡(P=0.29)、是否吸煙(P=0.89)、性別(P=0.32)、分期(P=0.52)及分化程度(P=0.62)無相關(guān)性，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與術(shù)后化療療效(P= 0.02)及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.01)有關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測hCTR1表達(dá)越高，療效越好、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越少(表1)。

表1 hCTR1表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 Association between 1 hCTR1 expression and clinicopathological data of NSCLC patients

2.3 手術(shù)后的化療副反應(yīng)觀察結(jié)果本研究中共54例，初次手術(shù)后進(jìn)行以順鉑為基礎(chǔ)的一線化療，觀察化療副反應(yīng)發(fā)生情況，其中消化道反應(yīng)，如胃腸道不適、惡心、嘔吐，腹瀉，有33人，占62.2%；血液毒性反應(yīng)，如白細(xì)胞下降，血小板減低，有4人，占7.5%；未發(fā)生神經(jīng)毒性反應(yīng)。副反應(yīng)大小按抗癌藥急性及亞急性毒性反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)(WHO標(biāo)準(zhǔn))［6］評估，副反應(yīng)大小與性別(P=0.87)及年齡(P=0.47)無明顯相關(guān)性，而與是否在化療前后采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施有關(guān)(P＜0.05)，而且應(yīng)用這些措施后副反應(yīng)較未用時(shí)明顯減小(表2)。

表2 化療藥物副作用大小與肺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.2 Association between side effects of chemotherapy and clinicopathological data of NSCLC patients

3 討 論

銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族包括hCTR1和銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸化ATP酶(copper transporting phosphorylated ATPase，ATP7A和ATP7B)。hCTR1是主要的銅離子攝入蛋白，研究證實(shí)參與鉑類抗腫瘤藥物的攝入［6］。人類CTR1蛋白位于9q31/32［7］，主要分布于細(xì)胞膜，由190個(gè)氨基酸組成，含有3個(gè)跨膜區(qū)，其中富含蛋氨酸和組氨酸的氨基端為結(jié)合銅離子所必需［8-9］。CTR1可以形成寡聚體復(fù)合物利于銅離子攝人，寡聚體復(fù)合物的形成受溫度、p H、K+濃度以及胞外銅離子濃度的影響［10］。

順鉑耐藥是一個(gè)多方面、多因素作用的結(jié)果，有研究證實(shí)鉑類耐藥的決定因素與鉑類藥的轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒、DNA損傷、DDR以及凋亡蛋白等有關(guān)。許多對順鉑耐藥的細(xì)胞，表現(xiàn)出對順鉑的攝入能力下降，具體原因還有待進(jìn)一步研究。盡管CTR1能夠介導(dǎo)順鉑的攝入，但是否由于hCTR1的本身表達(dá)缺失還是由于其功能缺陷，或由于人腫瘤組織中h CTR1的表達(dá)不同導(dǎo)致腫瘤對順鉑的藥物的敏感性，還不完全清楚。有研究報(bào)道，hCTR1的表達(dá)與以鉑類藥為基礎(chǔ)治療的腫瘤患者的療效及預(yù)后有相關(guān)性。CHEN等［4］采用免疫組化方法，研究發(fā)現(xiàn)54例初次接受鉑類化療的晚期NSCLC患者中hCTR1高表達(dá)的化療反應(yīng)效果越好，PFS(中位進(jìn)展生存期)及OS(總生存期)越好，提示h CTR1不僅是一種獨(dú)立的鉑類化療的預(yù)測因子，也是一種很好的預(yù)后因子。同時(shí)，LEE等［11］采用RT-PCR檢測了40例卵巢癌患者中CTR1和CTR2的表達(dá)水平，研究表明，hCTR1的高表達(dá)是對鉑類藥高敏感和高生存率預(yù)后的預(yù)測因子之一，而CTR2的高表達(dá)與CTR1的低表達(dá)的卵巢癌患者，對鉑類藥更耐藥和生存期更短。

本研究采用免疫組化方法檢測手術(shù)后NSCLC標(biāo)本中h CTR1表達(dá)情況，評估hCTR1與術(shù)后患者進(jìn)行2周期方案化療后在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化療療效等方面的關(guān)系，結(jié)果表明h CTR1表達(dá)在NSCLC組織中主要分布于癌細(xì)胞胞質(zhì)，h CTR1表達(dá)與化療療效(P=0.02)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.01)方面相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與患者年齡、性別、是否吸煙、病理類型、分化程度及臨床分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示hCTR1表達(dá)可以作為NSCLC患者化療療效的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一，這與CHEN等報(bào)道的一致。h CTR1表達(dá)越高，療效越好，因此提高肺癌的hCTR1表達(dá)水平，可以增加肺癌細(xì)胞對抗腫瘤細(xì)胞的敏感性，增加化療療效。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面h CTR1在37例轉(zhuǎn)移患者中陽性表達(dá)率僅為18.9%，低表達(dá)hCTR1患者淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移，而兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

鉑類藥被廣泛用于各種腫瘤化療，但其化療副反應(yīng)如耳毒性、外周神經(jīng)病變、體重減輕、惡心、嘔吐、腎毒性、癲癇發(fā)作、聽力損失和耳鳴等以及鉑類藥物的耐藥嚴(yán)重，影響了其化療療效［12］。西方國家患者對順鉑的副反應(yīng)大多為周圍神經(jīng)病變［13］，而我國大多為消化道副反應(yīng)和骨髓的抑制。原因可能為種族的不同、化療劑量、化療方案及與化療前后采取的措施等有關(guān)。本研究觀察發(fā)現(xiàn)在化療前后是否采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施，化療毒性反應(yīng)的分度上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，副反應(yīng)較未用水化及還原型谷胱甘肽等措施者明顯減小，而與年齡及性別關(guān)系不大。有研究發(fā)現(xiàn)，hCTR1的合成與谷胱甘肽含量有關(guān)［14］，因此增加谷胱甘肽含量可以增加腫瘤細(xì)胞對鉑類藥的敏感性［15］，同時(shí)減少了順鉑的副反應(yīng)，包括神經(jīng)毒性及消化道毒性。國外有研究報(bào)道通過姜黃素降低其神經(jīng)毒性［16］。

因此，臨床上可以通過檢測hCTR1的表達(dá)，預(yù)測NSCLC患者對以鉑類為基礎(chǔ)治療的化療療效及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，h CTR1表達(dá)越高，療效越好、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越少；同時(shí)對于存在有高表達(dá)的hCTR1肺癌術(shù)后患者進(jìn)行化療時(shí)，可以在化療前后采取水化、還原型谷胱甘肽、維生素B2及姜黃素等措施，可以減輕化療副反應(yīng)，提高化療療效并減輕患者痛苦。本實(shí)驗(yàn)為回顧性病例對照研究，因而可能存在選擇誤差，同時(shí)，由于樣本量所限，故研究結(jié)果還有待今后進(jìn)一步加大樣本量來驗(yàn)證。

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(編輯 國 榮)

Expression and clinical significance of hCTR1 in non-small cell lung cancer

YANG Tian，LI Yang，CHEN Tian-jun，GAO Lei，CHEN Ming-wei
(Respiratory Department，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the expression of human copper transporters 1(h CTR1)in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)and analyze its correlation with the clinicopathologic features andMethodsto reduce the clinical side effects of platinum drugs.MethodsIn the specimens of 54 lung cancer surgical patients treated with first-line cisplatin-based chemotherapy，the expression of h CTR1 protein was determined with immunohistochemistry.Then we analyzed its correlation with NSCLC clinical features，histological type，degree of differentiation，clinical stage，chemotherapy and side effects of chemotherapy.ResultsThe positive immune reaction of hCTR1 was observed mainly in cytoplasmic staining of NSCLC cells.The expression of hCTR1 had positive correlation with the response to cisplatin-based chemotherapy and lymph node metastasis(P=0.02 and 0.01，respectively).There was no significant correlation between h CTR1 expression and the following factors：age (P=0.29)，sex(P=0.32)，histological type(P=0.19)，clinical stage(P=0.52)，differentiation(P=0.62)and smoking(P=0.89).The side effects of chemotherapy was not related to age(P=0.47)and sex(P=0.87). However，h CTR1 expression was significantly related to receiving hydration，reduced glutathione，vitamin B2 and curcumin before and after chemotherapy(P＜0.05).ConclusionThe expression level of hCTR1 is an important factor that predicts the response to platinum-based chemotherapy and lymph node metastasis in NSCLC patients.For NSCLC patients with high h CTR1 expression，receiving hydration，reduced glutathione，vitamin B2 and curcumin before and after chemotherapy may reduce the side effects of chemotherapy.

non-small cell lung cancer(NSCLC)；human copper transporters 1(hCTR1)；cisplatin；side effects of chemotherapy

R734.2

A

1671-8259(2014)05-0651-04

10.7652/jdyxb201405016

2013-12-04

2014-04-16

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.2011K12-15) Supported by the Science and Technology Research Projects of Shaanxi Province(No.2011K12-15)

陳明偉，教授.E-mail：chenmingwei@mail.xjtu.edu.cn

陽甜(1983-)，女(漢族)，在讀博士生.研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床.E-mail：xiaojunjun0829@126.com

時(shí)間：2014-07-22 16∶20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1620.006.html