131I對甲狀腺HTori 3細(xì)胞凋亡及周期的影響

張偉曉，高 蕊，于 燕，郭 坤，劉 巖，喻銘啟，楊愛民

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科；2.公共衛(wèi)生系，陜西西安 710061)

131I對甲狀腺HTori 3細(xì)胞凋亡及周期的影響

張偉曉1，高 蕊1，于 燕2，郭 坤1，劉 巖1，喻銘啟1，楊愛民1

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科；2.公共衛(wèi)生系，陜西西安 710061)

目的研究131I誘導(dǎo)人甲狀腺HTori 3細(xì)胞凋亡、周期阻滯及其與Bcl-2、Fas等基因表達的關(guān)系。方法HTori 3細(xì)胞經(jīng)131I照射后，MTT方法檢測細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期分布；QRT-PCR及Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Fas的mRNA及蛋白表達水平的變化。結(jié)果MTT結(jié)果顯示不同放射性活度(7.4、14.8、29.6 MBq/mL)的131I作用于HTori 3細(xì)胞不同時間(24、48、72、96 h)后，對HTori 3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P＜0.05)。14.8 MBq/m L131I作用于細(xì)胞24、48、72 h后，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。14.8 MBq/m L131I作用細(xì)胞12、24、48 h后，G2/M期細(xì)胞所占百分比增加(P＜0.01)。實時定量PCR及Western blot結(jié)果均顯示抗凋亡基因Bcl-2表達降低(P＜0.05)，促凋亡基因Fas表達增加(P＜0.05)。結(jié)論131I能夠通過誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯抑制細(xì)胞增殖，Bcl-2及Fas均參與了131I誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞凋亡的過程。

131I；HTori 3細(xì)胞；凋亡；G2/M阻滯；Bcl-2；Fas

輻射射線可導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷。細(xì)胞通過細(xì)胞修復(fù)、周期阻滯或凋亡等非常精密的調(diào)控機制對此作出反應(yīng)，其中細(xì)胞凋亡是電離輻射所致細(xì)胞死亡的主要形式［1］。細(xì)胞周期阻滯可以為修復(fù)DNA損傷贏得足夠的時間，研究較多的細(xì)胞周期檢測點主要是G1/S期和G2/M期檢測點［2］。若DNA損傷程度嚴(yán)重以致無法成功修復(fù)時，機體則啟動凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。目前，關(guān)于電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及周期阻滯的研究主要集中于X射線和γ射線，而放射性核素β-射線的研究報道較少。131I半衰期為8.1 d，平均射程為910μm，是典型的釋放β-射線的放射性核素，相對較長的半衰期為核素發(fā)揮輻射治療作用提供了足夠的時間。131I以其組織特異性廣泛用于甲亢及分化型甲狀腺癌術(shù)后清甲治療［4-5］，還可標(biāo)記于特異性抗體用于非霍奇金淋巴瘤等其他腫瘤的治療［6］。本研究的目的旨在研究131I發(fā)射的β-射線誘導(dǎo)甲狀腺HTori 3細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的作用，并初步探討其生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器及主要試劑人甲狀腺HTori 3細(xì)胞由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌實驗室侯鵬教授饋贈。放射性核素131I由廣州希埃核醫(yī)藥中心提供。細(xì)胞凋亡試劑盒Annexin-VFLUOS為德國Roche公司產(chǎn)品。PCR引物由上海生工生物工程公司設(shè)計合成。Bcl-2及Fas抗體為美國Epitomics公司產(chǎn)品，內(nèi)參基因GAPDH抗體為美國Abmart公司產(chǎn)品。ELX800型酶標(biāo)儀為美國Biotek公司產(chǎn)品。FACS Calibur型流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。CFX96實時定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 MTT法檢測131I對HTori 3細(xì)胞的生長抑制作用將HTori 3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1.5×104/mL濃度接種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入不同放射性活度的131I(7.4、14.8、29.6 MBq/m L)，作用不同時間(24、48、72、96 h)。每孔加入20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入150μL DMSO，在搖床上低速震蕩10 min待結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀570 nm處測量各孔的吸光值A(chǔ)570。同時設(shè)調(diào)零孔及對照孔。按下列公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(實驗組A-空白對照A)/(對照組A -空白對照A)×100%

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率細(xì)胞以合適的濃度(5×104～1×105/m L)接種于六孔板，培養(yǎng)24 h后加入14.8 MBq/m L131I，對照組加入相同體積的PBS。經(jīng)131I處理不同時間(24、48、72 h)后，將培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液回收至15 m L離心管，3 m L PBS清洗兩遍，離心(1 000 r/min，5 min)，加入100μL Annexin-V-FLUOS緩沖液后上機檢測。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的再分布細(xì)胞以1 ×105/m L濃度接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后加入14.8 MBq/m L131I，對照組加入相同體積的PBS。經(jīng)131I處理不同時間(12、24、48 h)后，棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液回收至15 m L離心管中，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后加入3 m L 700 m L/L乙醇，在4℃冰箱中過夜保存。離心(1 000 r/min，5 min)后棄掉乙醇，繼續(xù)用PBS清洗細(xì)胞，加入PI后上機檢測。

1.5 實時定量PCR檢測Bcl-2及Fas mRNA表達水平的變化用RNAiso Reagent提取細(xì)胞RNA，分光光度計測量RNA濃度并計算260/280比值。內(nèi)參基因為人β-actin基因，上游引物序列為：5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'；下游引物序列為：5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3'；Bcl-2上游引物序列為：5'-ATGTGTGTGGAGAGGTCAACC-3'，下游引物序列為：5'-AGAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'；Fas上游引物序列為：5'-TGGCTTTGTCTTCTTCTTTTGC-3'；下游引物序列為：5'-CTTGGTTTTCCTTTCTGTGCTT-3'。加入500 ng RNA、2μL 5×PrimeScript Buffer、0.5μL Oligo d T Primer、0.5μL Random 6mers及RNase free H2O配制成10μL反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)程序為37℃15 min，85℃5 s。實時定量PCR反應(yīng)體系如下：10μL SYBR Premix Ex TaqTM，0.8μL PCR上游引物，0.8μL PCR下游引物，2μL模板(cDNA溶液)，6.4μL d H2O。采用兩步法PCR反應(yīng)程序。

1.6 Western blot檢測Bcl-2及Fas蛋白表達水平的變化收集陰性對照組、實驗組細(xì)胞，用PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，測定蛋白含量。灌制100 g/L的分離膠，50 g/L的濃縮膠的SDSPAGE凝膠。每個樣品槽內(nèi)加入150μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移PVDF膜上，PVDF膜用50 g/L牛血清白蛋白封閉液4℃封閉1 h后加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗(羊抗兔或羊抗鼠) 37℃孵育2 h，TBST洗膜，增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影，掃描。用Quantity One圖像分析系統(tǒng)掃描圖像的吸光度，以各組目的蛋白條帶吸光度值與內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度值計算相對比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗組細(xì)胞存活率與對照組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間細(xì)胞凋亡率、G2/M期百分比及相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SN K-q(Student-Newman-Keuls)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1131I對HTori 3細(xì)胞的生長抑制作用7.4、14.8、29.6 MBq/m L131I分別作用于HTori 3細(xì)胞24、48、72、96 h后，對細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用(圖1)，而且隨131I活度增加及作用時間延長，細(xì)胞存活率逐漸降低，具有時間及劑量依賴性。其中131I作用HTori 3細(xì)胞48 h的半數(shù)生長抑制活度為(27.75 ±2.22)MBq/m L。

圖1 不同放射性活度131I作用于HTori 3不同時間后對細(xì)胞生長的影響Fig.1 Effects of different radioactivity of131I on the growth of HTori 3 cell for different time points

2.2131I誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞凋亡14.8 MBq/m L131I作用細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(8.6 ±1.06)%、(39.9±1.88)%及(50.6±1.01)%，與對照組(6.5±0.6)%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，72 h細(xì)胞凋亡率顯著高于24 h及48 h(P＜0.01)，48 h細(xì)胞凋亡率顯著高于24 h(P＜0.01)。

2.3131I誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞G2/M期阻滯由表1可以看出，14.8 MBq/m L131I作用細(xì)胞12、24、48 h后，G2/M期細(xì)胞所占百分比逐漸增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。組間比較結(jié)果顯示24 h G2/M期細(xì)胞所占百分比高于12 h(P＜0.01)，而48 h G2/M期細(xì)胞所占百分比高于12 h及24 h(P＜0.01)。

2.4 Bcl-2和Fas mRNA表達水平的變化實時定量PCR顯示抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平降低，促凋亡基因Fas mRNA水平升高(圖2)。經(jīng)14.8 MBq/m L131I作用細(xì)胞12、24、48 h后Bcl-2 mRNA相對表達量降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，各實驗組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)14.8 MBq/m L131I作用細(xì)胞12、24、48 h后Fas m RNA相對表達量增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，各實驗組間比較，24 h和48 h Fas m RNA表達量均高于12 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，24 h和48 h Fas m RNA表達量比較，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 14.8 MBq/mL131I作用于HTori 3不同時間后對細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effects of 14.8 MBq/m L131I on cell cycle of HTori 3 cell for different time points

圖2 14.8 MBq/m L131I作用于HTori 3細(xì)胞不同時間后Bcl-2和Fas mRNA表達水平的變化Fig.2 Bcl-2 and Fas mRNA expressions in HTori 3 cell after 14.8 MBq/m L131I treatment for different time points

2.5 Bcl-2和Fas蛋白表達水平的變化Western blot結(jié)果顯示抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達水平降低，促凋亡基因Fas蛋白表達水平升高(圖3)。對照組和經(jīng)14.8 MBq/m L131I作用不同時間(12、24、48 h)后細(xì)胞Bcl-2蛋白的相對吸光度值分別為0.77±0. 24、0.84±1.06、0.33±0.47和0.16±0.73，多組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，兩組間比較發(fā)現(xiàn)，24 h和48 h Bcl-2蛋白表達量均低于12 h，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而12 h Bcl-2蛋白表達量與對照組比較無明顯差異。對照組和經(jīng)14.8 MBq/m L131I作用不同時間(12、24、48 h)后細(xì)胞Fas蛋白的相對吸光度值分別為0.40±0.71、0.26± 0.35、0.82±1.07和0.82±0.47，多組間比較，差異有顯著性(P＜0.01)，兩組間比較發(fā)現(xiàn)，24 h和48 h Fas蛋白表達量均高于12 h，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而12 h Fas蛋白表達量與對照組相比無明顯差異。說明經(jīng)131I處理24 h后，凋亡相關(guān)基因表達發(fā)生變化，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達水平降低，促凋亡基因Fas蛋白表達水平升高，這與細(xì)胞凋亡的發(fā)生時間是一致的。

圖3 14.8 MBq/mL131I處理HTori 3不同時間后Fas和Bcl-2蛋白表達水平的變化Fig.3 Fas and Bcl-2 protein expressions of HTori 3 cell after 14.8 MBq/m L131I treatment for different time points

3 討 論

目前，關(guān)于電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的研究主要集中于X射線和γ射線，而關(guān)于放射性核素β-射線的研究報道較少。與外照射不同，放射性核素內(nèi)照射具有輻射作用時間的持續(xù)性和作用效應(yīng)的累積性等特點。因此，研究放射性核素β-射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及其細(xì)胞、分子生物學(xué)機制具有重要意義。

電離輻射是放射核素治療的基礎(chǔ)，是射線引起物理、化學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)的機制之一。電離輻射致DNA損傷的嚴(yán)重程度與射線類型及放射劑量等因素有關(guān)。傳能線性密度越高，帶電粒子的電離作用越強，致DNA損傷越嚴(yán)重。本結(jié)果顯示131I對甲狀腺細(xì)胞HTori 3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，而且隨著131I放射劑量的增加及作用時間的延長，細(xì)胞增殖抑制率增加。說明131I抑制細(xì)胞增殖與其放射劑量及照射時間等因素有關(guān)，這就為臨床上以合適的放射劑量、適當(dāng)?shù)臅r間及作用方式治療疾病提供了理論依據(jù)。

放療及化療致DNA損傷均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯［7-8］，這對于維持基因組的穩(wěn)定性具有重要意義。研究表明γ射線能夠誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯［8］，89Sr Cl2發(fā)射的β-射線亦能夠誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞G2/M期阻滯［9］。本研究結(jié)果表明131I對HTori 3細(xì)胞有明顯的G2/M期阻滯作用，而且與131I的作用時間呈正相關(guān)。細(xì)胞凋亡途徑分為線粒體途徑及死亡受體途徑。線粒體途徑主要是由Bcl-2家族基因調(diào)節(jié)。Bcl-2家族分為抗凋亡基因如Bcl-2和促凋亡基因如Bax，Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡［10-11］。Fas是死亡受體途徑中的重要分子，F(xiàn)as受體與配體結(jié)合后可通過啟動死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。本結(jié)果顯示，經(jīng)131I處理后，細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)131I作用甲狀腺HTori 3細(xì)胞24 h后，RT-PCR及Western blot結(jié)果均顯示Bcl-2基因表達降低，F(xiàn)as基因表達升高，與細(xì)胞凋亡發(fā)生的時間是一致的。說明Bcl-2及Fas均參與了131I誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞凋亡的過程，而且是通過線粒體途徑及死亡受體途徑共同實現(xiàn)的。這一結(jié)果與報道基本一致。張軍寧等［13］在89Sr誘發(fā)K562癌細(xì)胞凋亡放射毒理效應(yīng)的分子機制的研究中發(fā)現(xiàn)89Sr發(fā)射的β-射線照射K562細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死與對照組相比均有所增加，且89Sr誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡可能是通過Bcl-2 mRNA及其蛋白表達降低，Bcl-2/Bax比值下降而調(diào)控的。鄒保民等［14］報道的188Reβ-射線也能誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡，Bcl-2及Bax基因均參與了188Re誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。

總之，131I能夠誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯。Bcl-2及Fas均參與了131I誘導(dǎo)HTori 3細(xì)胞凋亡的過程。以上研究為臨床應(yīng)用放射性核素131I治療疾病提供了理論依據(jù)。

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(編輯 韓維棟)

Effects of radioiodine-131 on apoptosis and cell cycle of human thyrocyte cell line HTori 3

ZHANG Wei-xiao1，GAO Rui1，YU Yan2，GUO Kun1，LIU Yan1，YU Ming-qi1，YANG Ai-min1
(1.Department of Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University；2.Department of Public Health，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the effects of radioiodine-131 on cell apoptosis and cell cycle of HTori 3 cell line and the related mechanisms.MethodsThe cell viability of HTori 3 cell line was quantitated by methylthiazolyl-tetrazolium assay(MTT)；cell apoptosis and cell cycle arrest were determined by flow cytometry. Quantitative real-time PCR and Western blot assay were performed to determine the changes of Bcl-2 and Fas expressions after radioiodine-131 irradiation.ResultsIodine-131 of different radioactivity(7.4，14.8 and 29.6 MBq/m L)could significantly inhibit HTori 3 cell growth for different time points(24，48，72 and 96 h)(P＜0.05).Iodine-131 of 14.8 MBq/m L could induce cell apoptosis after different time(24，48 and 72 h)(P＜0.05). The percentage of G2/M cells was increased compared with that of the controls after 14.8 MBq/m L iodine-131 treatment for different time(24，48 and 72 h)(P＜0.01).Up-regulation of Fas and down-regulation of Bcl-2 were observed after radioactive iodine-131 treatment(P＜0.05).ConclusionIodine-131 can inhibit HTori 3 cell growth via cell apoptosis and G2/M arrest.Down-regulating of Bcl-2 and up-regulating Fas are involved in the apoptosis induced by iodine-131.

iodine-131；HTori 3；apoptosis；G2/M arrest；Bcl-2；Fas

R817.8

A

1671-8259(2014)05-0630-04

10.7652/jdyxb201405012

2014-03-10

2014-05-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81172598) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81172598)

楊愛民，主任醫(yī)師.E-mail：yangaimin@mail.xjtu.edu.cn

張偉曉(1987-)，女(漢族)，在讀碩士研究生.研究方向：131I核素治療.E-mail：elinasmile@126.com

時間：2014-07-22 18∶12 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1812.017.html