蝦青素預處理對體外氧化應激誘導內(nèi)皮祖細胞凋亡的保護作用

龔志剛，張再偉，姜其鈞，丁世芳

(1.南方醫(yī)科大學研究生院，廣東廣州 510515；2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢 430070；3.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061)

蝦青素預處理對體外氧化應激誘導內(nèi)皮祖細胞凋亡的保護作用

龔志剛1，2，張再偉3，姜其鈞2，丁世芳2

(1.南方醫(yī)科大學研究生院，廣東廣州 510515；2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢 430070；3.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061)

目的探討蝦青素對體外氧化應激誘導的人外周血內(nèi)皮祖細胞凋亡的影響及機制。方法體外培養(yǎng)人外周血單核細胞源的內(nèi)皮祖細胞，分為正常對照組、模型組(叔丁基過氧化氫100μmol/L)、蝦青素+叔丁基過氧化氫(蝦青素0.1、1、10 nmol/L預處理24 h后，再加終濃度為100μmol/L的叔丁基過氧化氫溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h)組。MTT法檢測細胞存活率；DAPI染細胞檢測細胞凋亡率；DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平；比色法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)活性；JC-1法測定線粒體膜電位。結果與正常對照組比較，叔丁基過氧化氫(100μmol/L)能明顯造成內(nèi)皮祖細胞凋亡(P＜0.05)。蝦青素可降低叔丁基過氧化氫引起的內(nèi)皮祖細胞凋亡，表現(xiàn)為細胞凋亡率減少(P＜0.05)，線粒體膜電位增加，Caspase3表達減弱。結論蝦青素對叔丁基過氧化氫誘導的內(nèi)皮祖細胞凋亡具有保護作用，其機制可能與保護線粒體功能有關。

氧化應激；內(nèi)皮祖細胞；蝦青素；細胞凋亡；線粒體膜電位

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是成人最重要的一組調節(jié)血管新生和形成血管內(nèi)皮的祖細胞，其在外周循環(huán)血中的數(shù)量與功能是促進內(nèi)皮修復，進行再內(nèi)皮化，維持其完整的重要因素［1］。

近年來的研究表明，EPCs對氧化應激損傷敏感［2］；臨床觀察也證實，冠心病的危險因素如吸煙、高氧化低密度脂蛋白血癥、高血壓、糖尿病，缺血再灌注損傷、經(jīng)皮冠脈介入治療損傷［3］。由此引起內(nèi)皮祖細胞損傷和凋亡的，可能是患者外周血EPCs的數(shù)量及功能受損的直接原因。因此，增強EPCs抗氧化應激能力，降低凋亡的發(fā)生，改善其功能，可能是血管損傷后再內(nèi)皮化治療的新靶點［4］。

蝦青素(astaxanthin，ASX)是雨生紅球藻在受到環(huán)境脅迫時，細胞為抵御不良環(huán)境而形成的應激機制中的一種分子，對氧化應激引起的多種細胞，如人神經(jīng)干細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞、腎小球系膜細胞、視網(wǎng)膜細胞等的凋亡具有顯著保護作用［5-8］。但ASX對EPCs是否抗氧化應激損傷引起凋亡，目前尚未見報道。

本研究利用體外培養(yǎng)人外周血單核細胞源的EPCs，叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)干預EPCs制作氧化應激損傷模型，觀察ASX對t BHP誘導EPCs凋亡的保護作用，探討ASX對人EPCs的抗凋亡功能及可能機制，為深入研究ASX的心血管保護作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑Histopaque1077淋巴細胞分離液(美國Amersham Biosciences公司)；M199培養(yǎng)基、胎牛血清、細胞培養(yǎng)板(美國Gibico公司)；胰酶(上海博光生物技術公司)；硫氰酸熒光標記荊豆凝集

素I(FITC-UEA-I)、人纖維連接蛋白、ASX、tBHP、MTT(甲基噻唑藍)(美國Sigma公司)；乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)(美國Molecular Probe公司)；重組人血管內(nèi)皮生長因子(rh-VEGF165)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-b-FGF)(英國Pepro Tech公司)；PE標記鼠抗人CD133單克隆抗體(德國Miltenyi Biotec公司)；FITC標記鼠抗人CD34單克隆抗體(美國Southern Biotech公司)；PE標記鼠抗人VEGF-R2單克隆抗體、Caspases活性檢測試劑盒(美國R&D System公司)；ROS檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、DAPI Apoptosis Detection試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 人內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定取健康志愿者外周血，以1∶2比例的PBS稀釋后，緩慢移至Histopaque1077淋巴細胞分離液上方，400×g室溫離心30 min，分離出中間單個核細胞層。將分離好的單核細胞用含有100 m L/L PBS、200 m L/L胎牛血清、rh-VEGF 10 ng/m L、rh-b-FGF 10 ng/m L的M199培養(yǎng)液稀釋成5×106/m L，放置于37℃、50 m L/L CO2孵箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)到第4天，用PBS洗掉非貼壁細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；取第7天的細胞，加入2.4 mg/L DiI-Ac-LDL和10 mg/L FITC-UEA-I于37℃孵育1h后，用熒光顯微鏡檢測雙染色陽性細胞百分比。另取第7天的細胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，分別加入10 mg/L PE標記的VEGF-R2單克隆抗體、10 mg/L PE標記的CD133單克隆抗體、10 mg/L FITC標記的CD34抗體，4℃孵育30 min后，上流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達率。于第7天加入無血清的培養(yǎng)液同步化細胞24 h，進行后續(xù)實驗。

1.3 人內(nèi)皮祖細胞tBHP損傷模型的建立同步化后的EPCs用2.5 g/L胰酶消化，以1×103/孔的密度接種于96孔板，分別加入濃度為30、60、120、240 μmol/L的tBHP干預6 h，加入10μL MTT(5 g/L)在37℃孵育4 h后吸去上清，加入100μL二甲基亞砜，振蕩10 min溶解結晶，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。根據(jù)細胞存活情況選擇合適的tBHP作用濃度用于后續(xù)干預實驗。細胞存活率(%)=(實驗組A值/正常對照組A值)×100%

1.4 ASX對正常和損傷細胞存活率的影響待細胞長到鋪滿板底70%～80%時，加入終濃度分別為0.1、1、10 nmol/L的ASX溶液，于37℃孵育24 h后換為無血清MEM，再加終濃度為100μmol/L的tBHP溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，MTT法檢測細胞存活率。

1.5 細胞凋亡率的測定藥物處理好的細胞除去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，binding buffer重懸并調整細胞數(shù)為1×106/m L，然后用40 g/L的多聚甲醛固定15 min，用DAPI(2.5μg/m L)染核20 min，在熒光顯微鏡下拍攝細胞圖像觀察細胞核形態(tài)。熒光顯微鏡下，活細胞核呈彌散均勻熒光，細胞凋亡時，細胞核或細胞質內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，核出現(xiàn)不同程度的固縮，可見DNA熒光碎片(凋亡小體)。分別選取5個視野，并計數(shù)100個細胞，計算細胞凋亡小體形成率(凋亡小體細胞數(shù)/總的細胞數(shù)×100%)，取5次結果的平均值來評價細胞凋亡率。

1.6 Caspase-3活性的測定按Caspase-3 Colorimeric Assay Kit說明書進行。1×106細胞溶于50μL細胞溶解液后，加入2×反應緩沖液50μL和酶底物(DEVD-pNA)5μL，37℃孵育1 h，用酶標儀在405 nm波長下測吸光度(A)值。

1.7 細胞內(nèi)ROS水平的測定采用DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS水平。接種于96孔板，經(jīng)藥物處理后的各組EPCs，用10μmol/L DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)液于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗3次以去除探針，酶標儀檢測DCF，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。DCF相對熒光強度(%)=處理組的熒光值/對照組的熒光值×100%。

1.8 細胞線粒體膜電位的測定采用JC-1法。接種于96孔板，經(jīng)藥物處理后的各組EPCs，除去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，滴加100μL JC-1工作液，37℃、50 m L/L CO2孵箱中培養(yǎng)20 min，1×Incubation Buffer洗2遍，于熒光顯微鏡下觀察。JC-1是一種陽離子脂質熒光染料，作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，低濃度時以單體形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常細胞線粒體的膜電位(ΔΨ)具有極性，JC-1依賴于ΔΨ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；而在線粒體膜通透性改變，線粒體膜電位去極化時，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質內(nèi)發(fā)綠色熒光。根據(jù)這一特征檢測線粒體膜電位的變化。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示，采用單因素方差分析(One way ANOVA)和LSD進行多樣本間均值比較，采用Levene進行方差齊性檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

高校第二課堂是第一課堂的補充，它不受時間和空間的限制，具備多種形式,成為素質發(fā)展、創(chuàng)新意識培養(yǎng)和實踐能力提升的重要載體，正是由于第二課堂教學的靈活性和新穎性,使其越來越受到高校的重視。

2 結 果

2.1 EPCs的形態(tài)與鑒定EPCs體外培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)集落，4 d后多數(shù)集落已經(jīng)形成，于第7天后加入DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色，其中90%細胞吞噬DiI-Ac-LDL(熒光顯微鏡下呈紅色)，F(xiàn)ITC-UEA-I (熒光顯微鏡下呈綠色)染色陽性(圖1)。采用PE標記的鼠抗人CD133、FITC標記的鼠抗人CD34以及PE標記的鼠抗人VEGF-R2抗體于流式細胞儀檢測細胞表面標志，結果顯示，CD133、CD34及VEGF-R2陽性率分別為(89.5±5.3)%、(66.3±6.3)%和(93.1± 8.3)%，證實所分離培養(yǎng)的細胞為EPCs。

圖1 EPCs的熒光染色鑒定Fig.1 Fluorescent staining of EPCs

2.2 tBHP損傷EPCs模型的建立MTT檢測結果顯示，不同濃度t BHP作用EPCs 6 h后，細胞存活率表現(xiàn)為隨藥物濃度增加而降低的劑量依賴關系。當tBHP濃度在30μmol/L時，細胞存活率為(83.61± 10.12)%，60μmol/L時為(65.11±8.86)%，120 μmol/L時為(34.72±13.22)%，至最大濃度240 μmol/L時，細胞大部分死亡，細胞存活率為(6.34± 4.66)%，其與對照組(100%)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當tBHP濃度為100μmol/L左右時，細胞存活率約維持在50%，后續(xù)實驗選擇該條件建立tBHP誘導EPCs的氧化損傷模型。

2.3 ASX對tBHP誘導的內(nèi)皮祖細胞存活率下降的影響MTT結果顯示，預實驗中給予濃度0.1、1、10 nmol/L的ASX對EPCs的存活率沒有影響。與損傷模型組相比較，各實驗濃度的ASX呈劑量依賴性提高細胞存活率，當ASX的濃度達到10 nmol/L時，細胞存活率從47.6%升高至85.3%，顯著提高EPCs存活率(P＜0.05，圖2)。

2.4 ASX對tBHP誘導EPCs凋亡的影響應用DAPI染細胞檢測ASX對tBHP引起EPCs凋亡的影響。tBHP 100μmol/L處理EPCs 6 h后，細胞出現(xiàn)典型的凋亡核形態(tài)學改變。與對照組相比，細胞染色質濃縮，核固縮明顯，凋亡小體數(shù)目顯著增加，ASX預處理24 h后，可顯著改善細胞凋亡狀況，隨著作用濃度的增加，作用逐步增強，在10 nmol/L ASX濃度時，改善最為顯著。經(jīng)過凋亡小體計算統(tǒng)計，正常對照組凋亡小體形成率為(4.8±0.7)%，100μmol/L t BHP損傷6 h組凋亡小體形成率(27.8±3.2)%，與正常對照組相比明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，n=6)，ASX在0.1、1、10 nmol/L預處理24 h后再加100μmol/L tBHP處理6 h，凋亡小體形成率分別為(20.4±2.9)%，(14.9±1.7)%和(7.8±0. 7)%(P＜0.05，n=6)，可見，ASX對tBHP誘導的細胞凋亡具有明顯的保護作用(圖3)。

圖2 各組內(nèi)皮祖細胞存活率的檢測及觀察Fig.2 EPCs viability test(，n=6)

圖3 各組內(nèi)皮祖細胞凋亡的檢測Fig.3 EPCs apoptosis test(，n=6)

2.5 ASX對tBHP誘導EPCs caspase-3活性的影響應用紫外分光光度法進行檢測，結果顯示，與正常對照組相比，t BHP誘導EPCs Caspase-3活性顯著升高(P＜0.05)；而經(jīng)ASX預處理24 h后，Caspase-3活性出現(xiàn)逆轉現(xiàn)象，隨著劑量加大而下降(P＜0.05)，提示ASX可通過調節(jié)Caspase-3活性抑制tBHP誘導的EPCs細胞凋亡(表1)。

2.6 ASX對細胞內(nèi)ROS的影響tBHP滲透進入細胞，迅速轉化為叔丁氧基，并進而促進細胞內(nèi)ROS的形成。DCHF-DA是檢測細胞內(nèi)ROS的分子探針，其本身無熒光，當它進入細胞與細胞內(nèi)ROS結合時，產(chǎn)生一種熒光物質DCF，DCF的熒光強度反映了細胞內(nèi)ROS水平。本實驗結果顯示，100μmol/L t BHP損傷組，EPC細胞內(nèi)ROS水平顯著增加；而經(jīng)ASX(0.1、1、10 nmol/L)預處理組，EPCs細胞內(nèi)ROS水平呈劑量依賴性降低，在10 nmol/L ASX濃度時，降低ROS水平最為顯著，熒光強度較損傷模型組明顯減弱(圖4)。

表1 ASX對tBHP誘導EPCs Caspase-3活性的影響Tab.1 Effect of ASX on Caspase-3 activity of EPCs injured by tBHP(n=6，)

表1 ASX對tBHP誘導EPCs Caspase-3活性的影響Tab.1 Effect of ASX on Caspase-3 activity of EPCs injured by tBHP(n=6，)

與對照組比較，△P＜0.05，與tBHP損傷模型組比較，*P＜0.05。

組別Caspase-3活性(A405nm) 0.096±0.014 tBHP 0.345±0.018△0.1 nmol/L ASX+tBHP 0.291±0.013*1 nmol/L ASX+tBHP 0.209±0.004*10 nmol/L ASX+tBHP 0.169±0.013對照組*

2.7 EPCs線粒體膜電位的檢測結果結果顯示，正常對照組(Control)為黃綠色，100μmol/L tBHP處理6 h(tBHP+/ASX-)，線粒體膜電位丟失，綠色熒光強度變強，而經(jīng)10 nmol/L ASX預處理24 h后(tBHP+/ASX+)，其線粒體膜電位丟失得以明顯抑制，呈現(xiàn)黃綠素熒光，但較對照組黃綠色稍偏綠。說明ASX能抑制tBHP引起的EPCs線粒體膜電位去極化，從而提高線粒體膜電位水平，進而對線粒體膜電位丟失促發(fā)的EPCs凋亡具有一定的保護作用(圖5)。

圖4 ASX對細胞內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effects of ASX on intracellular ROS(，n=6)

圖5 各組內(nèi)皮祖細胞線粒體膜電位的檢測Fig.5 Mitochondrial membrane potential of EPCs in each group

3 討 論

ASX分子式：C4OH52O4，相對分子量596.86，是一種酮式類胡蘿卜素，源自雨生紅球藻類受到較長時間環(huán)境脅迫時，細胞內(nèi)產(chǎn)生的一種抵御不良環(huán)境，具有多種生物活性的物質，其極高的抗氧化活性，可應對細胞內(nèi)氧化應激造成的損傷，使細胞渡過難關［10］。tBHP是用于構建細胞氧化損傷的常用試劑，其化學性質與過氧化氫(H2O2)相似，但更穩(wěn)定，不易降解。tBHP能模擬氧化應激損傷，直接破壞膜結構，最終導致細胞或線粒體膜的破壞［11］。

細胞凋亡是多基因、多種分子參與的復雜生命過程。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3是細胞凋亡發(fā)生和調控機制中的重要分子，是凋亡途徑下游進行底物酶解的關鍵蛋白酶，Caspase-3的激活是凋亡發(fā)生的最早期事件，它對染色質固縮、DNA片段化起重要的執(zhí)行作用［12］。本研究通過DAPI檢測發(fā)現(xiàn)，tBHP可明顯的引起內(nèi)皮祖細胞的凋亡，單純ASX對內(nèi)皮祖細胞無損傷作用，ASX對tBHP誘導的內(nèi)皮祖細胞凋亡具有明顯的保護作用。在ASX抑制EPCs的凋亡中發(fā)現(xiàn)ASX對Caspase-3的活性有下調效應，在10 nmol/L水平能顯著抑制其激活。

線粒體是最重要的細胞凋亡調控靶點，同時，線粒體還是ROS的主要來源，并易受氧化應激損傷。研究表明，胞質內(nèi)ROS可作為信號誘導線粒體通透轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放、Ca2+內(nèi)流和線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)，同時促進自身線粒體及其他線粒體產(chǎn)生ROS，ROS升高又進一步誘導MPTP開放，兩者互為因果，形成惡性循環(huán)［13］。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)下降是MPTP開放的表征，MMP下降，氧化磷酸化解偶聯(lián)，線粒體基質腫脹，外膜破裂，導致各種凋亡因子包括最重要的細胞色素C釋放于胞質中，啟動細胞線粒體途徑凋亡級聯(lián)反應，激活Caspase-3，從而使細胞發(fā)生凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，tBHP損傷組細胞內(nèi)ROS顯著增加，線粒體膜電位明顯低于空白對照組，而ASX保護組的細胞內(nèi)ROS水平下降，線粒體膜電位較損傷組有明顯的提高?？梢?，tBHP增加細胞內(nèi)ROS，降低EPCs線粒體膜電位，啟動了線粒體途徑細胞凋亡，而ASX能明顯減少ROS生成，提高EPCs線粒體膜電位，抑制tBHP誘導的線粒體途徑細胞凋亡。

綜上所述，本研究結果顯示，ASX通過提高線粒體膜電位，抑制細胞內(nèi)ROS生成造成的線粒體氧化應激損傷，可能進而下調Caspase-3活性，最終起到抗EPCs凋亡的功能。本研究為ASX抗氧化應激損傷，改善EPCs數(shù)量和功能，促進損傷血管再內(nèi)皮化提供了實驗依據(jù)。

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(編輯 卓選鵬)

Astaxanthin attenuates endothelial progenitor cell apoptosis induced by oxidative stress via mitochondria-targeted protective mechanism

GONG Zhi-gang1，2，Zhang Zai-wei3，JIANG Qi-jun2，DING Shi-fang2
(1.Graduate School，Southern Medical University，Guangzhou 510515；2.Department of Cardiology，Wuhan General Hospital of Guangzhou Command，Wuhan 430070；3.Department of Cardiovascular Medicine，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the effects of astaxanthin on oxidative stress-induced apoptosis of endothelial progenitor cells(EPCs)in vitro and to explore its underlying mechanisms.MethodsEPCs cultured in vitro were divided into normal control group，model group(100μmol/L tBHP)，and astaxanthin plus tBHP(pretreated with 0.1，1，10 nmol/L astaxanthin for 24 h and then cultured with 100μmol/L tBHP for 6 h).The cell viability was measured by MTT method；the level of reactive oxygen species(ROS)was determined by DCFH-DA method；the changes of mitochondrial membrane potential(MMP)and apoptosis ratio were detected by JC-1 method and DAPI method，respectively.Caspase 3 was assayed by colorimetry.ResultsCompared with normal control group，100μmol/L tBHP obviously caused the apoptosis of EPCs(P＜0.05)，while astaxanthin could reduce this damage，which was presented by the significantly decreased cell apoptosis ratio(P＜0.05)，increased MMP and downregulated Caspase-3 expression.ConclusionAstaxanthin inhibits oxidative stress-induced apoptosis of EPCs，and its mechanisms may be related to protecting the mitochondrial function.

oxidative stress；endothelial progenitor cell；astaxanthin；cell apoptosis；mitochondrial membrane potential

R285

A

1671-8259(2014)05-0599-06

10.7652/jdyxb201405007

2014-01-05

2014-03-20

湖北省自然科學基金資助項目(No.2012FFB06803) Supported by the Natural Science Foundation of Hubei Province(No.2012FFB06803)

丁世芳，主任醫(yī)師，教授.研究方向：心血管內(nèi)科臨床與基礎研究.E-mail：dingshifangmd@yahoo.com.cn

龔志剛(1971-)，男(漢族)，副主任醫(yī)師，博士研究生.研究方向：心血管內(nèi)科臨床研究.E-mail：13397199595@189.cn；張再偉(1970-)，男(漢族)，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師.研究方向：心血管內(nèi)科疾病.E-mail：zhzw2001@stu.xjtu.edu.cn，共同第一作者.

時間：2014-05-16 16∶03 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140524.2118.004.html