兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

李書光，胡琳琳，李 峰，林初文，張 娜，劉吉山，楊立芳，沈志強

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100083；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

隨著家兔集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展，兔支氣管敗血波氏桿菌成為困擾家兔養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。該病原菌在自然界中分布廣泛，為家兔的呼吸道常在菌，應激或者其他因素導致機體免疫力下降會引起家兔的慢性鼻炎、咽炎、支氣管肺炎及膿包型肺炎等癥狀［1-2］。該病常發(fā)生于春秋季節(jié)，不同年齡的家兔均易感。幼兔、仔兔常呈急性型，成年兔一般呈慢性型。一旦兔群發(fā)病，能夠通過空氣傳播迅速波及全群，不及時控制該病，能夠?qū)е赂哌_50%的病死率。

2014年3月初山東棗莊某大型養(yǎng)殖場帶病兔來到山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院技術(shù)服務中心開展疾病診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 山東棗莊某兔場送檢病兔。

1.1.2 試劑及動物 胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，美國BD公司產(chǎn)品；試驗用藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)中心產(chǎn)品；昆明系小鼠，購自山東大學；試驗用30d健康易感兔，購自濱州某兔場，試驗前取試驗兔鼻拭子進行PCR檢測，無兔支氣管敗血波氏桿菌感染。

1.2 方法

1.2.1 病兔的剖檢觀察及病料采集 按照常規(guī)方法無菌處理家兔體表，觀察臨床癥狀，無菌操作取主要病變部位及肝臟、脾臟等組織，為后期試驗做好準備。

1.2.2 病原菌的分離 取主要病變組織肺臟新鮮創(chuàng)面，涂布加血的TSA培養(yǎng)基，同時使用脾臟、肝臟等同樣做細菌的分離鑒定，培養(yǎng)30h左右，觀察分離菌株的生長狀態(tài)，并挑取典型菌落涂片，革蘭染色鏡檢。

1.2.3 病兔疾病的特異性PCR病原檢測 取肝臟、脾臟、肺臟組織開展兔瘟的PCR檢測，取分離的優(yōu)勢病原菌開展常見病原菌的多重PCR檢測［3］。

1.2.4 藥物敏感性試驗 無菌放置干燥抗菌藥物紙片緊貼于密集劃線接種了菌種的培養(yǎng)基表面，每個直徑90mm的平皿貼7個藥敏紙片，蓋上平皿，倒置平皿置37℃溫箱培養(yǎng)24h，取出測量觀察結(jié)果，判斷標準按2010版CLSI M100-S20執(zhí)行，≤5 mm為不敏感；≥6mm≤10mm為低度敏感；≥11 mm≤20mm為敏感；≥21mm為高度敏感。使用篩選到的敏感藥物配合波氏桿菌疫苗對兔群進行綜合防控。

1.2.5 動物致病性試驗

1.2.5.1 小鼠的致病性試驗 挑取鑒定純培養(yǎng)的兔支氣管敗血波氏桿菌分離株，接種于成品TSB中37℃培養(yǎng)18h后，活菌倍比稀釋計數(shù)，調(diào)整濃度至1×109CFU／mL。10只20g左右的健康昆明系小鼠，隨機分成2組，每組5只，1號組腹腔注射0.2mL菌液，2號組腹腔注射等量生理鹽水做對照組，隔離飼養(yǎng)觀察7d。

1.2.5.2 30d家兔的致病性試驗 挑取鑒定純培養(yǎng)的兔支氣管敗血波氏桿菌分離株，接種于成品TSB中37℃培養(yǎng)18h后，活菌計數(shù)，調(diào)整濃度至1×109CFU／mL。6只30d左右的健康、PCR檢測無波氏桿菌污染的新西蘭白兔，隨機分成2組，每組3只，1號組耳靜脈注射0.2mL菌液，2號組耳靜脈注射等量生理鹽水作為對照組，隔離飼養(yǎng)觀察14d。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病狀況

該批家兔發(fā)病日齡約30d，每天有2%左右的死亡率，用過兔瘟疫苗和瘟巴二聯(lián)疫苗，沒用過波氏桿菌的疫苗，病兔精神不振、被毛蓬亂，有的兔子流膿性鼻液或黏液。剖檢可以觀察到肺充血水腫，有出血點偶見化膿灶，鼻腔、咽喉部及氣管內(nèi)有淡黃色黏液，其他臨床癥狀不明顯。

2.2 病原菌的分離培養(yǎng)

取病死兔的肺臟、肝臟、脾臟進行病原菌的分離培養(yǎng)；脾臟和肝臟病料在TSA培養(yǎng)基上基本無細菌生長，肺臟病料有兩種菌落生長（經(jīng)鑒定另一種為大腸埃希菌），其中一種優(yōu)勢菌菌落光滑致密，呈灰白色突起。經(jīng)革蘭染色鏡檢為革蘭陰性短小桿菌，大小均一（圖1）。

圖1 分離菌的革蘭染色鏡檢（1 000×）Fig.1 Gram staining bacterial under microscope（1 000×）

2.3 病原菌的PCR種屬鑒定

挑取單菌落進行PCR種屬的鑒定，圖2中顯示可見260bp處有一條目的條帶，可以確定該分離株為兔支氣管敗血波氏桿菌。

圖2 波氏桿菌PCR鑒定Fig.2 PCR identification of Bordetella

2.4 藥物敏感試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，氟苯尼考、多西環(huán)素、紅霉素為高敏藥物；四環(huán)素、鏈霉素中敏；對阿莫西林等9種藥物耐藥，試驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 藥物敏感性試驗結(jié)果Table 1 The results of drug susceptibility test

2.5 致病性試驗

昆明系小鼠在接種后表現(xiàn)精神沉郁，16h左右時1號攻毒組5只全部死亡，2號對照組一切正常。家兔組1號攻毒組和2號對照組，觀察7d均未死亡，且沒有明顯的癥狀差異，攻毒7d后剖檢觀察，1號攻毒組未出現(xiàn)明顯的肺臟異常，僅鼻腔出現(xiàn)輕微的充血和稍渾濁黏液。證實該分離株對小鼠有一定的致病力，但是對健康家兔致病力不強。

2.6 藥物防治

根據(jù)病原分離結(jié)果及藥敏試驗結(jié)果，使用波氏桿菌疫苗緊急防疫并配合氟苯尼考針劑注射，迅速控制了兔群的持續(xù)性死亡。

3 討論

根據(jù)發(fā)病兔中分離菌的培養(yǎng)特性、染色鏡檢、PCR檢測等快速確定病兔肺臟優(yōu)勢分離病原菌為兔支氣管敗血波氏桿菌［4］。該病原菌對昆明系小鼠具有較強的致病性，但是在使用本動物進行攻毒試驗時，未出現(xiàn)典型的發(fā)病和病變，可能和實驗動物中心養(yǎng)殖環(huán)境較好有關(guān)，在該試驗條件下無法復制發(fā)病兔場的應激環(huán)境［5-6］。另外，在本試驗中使用肺臟進行病原菌分離鑒定，其中還有一種細菌經(jīng)PCR鑒定為大腸埃希菌，其分離率僅為1%～2%，因此，可以確定本次疫情的主要致病菌是兔支氣管敗血波氏桿菌。

兔支氣管敗血波氏桿菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要是病原菌的革蘭染色、鏡檢及生化試驗，在本文試驗過程中采用傳統(tǒng)方法和分子生物學相結(jié)合的試驗方法［7-8］，首先使用傳統(tǒng)方法進行革蘭染色鏡檢確定細菌的大致形態(tài)，為分子生物學檢測方法指明方向，在此基礎(chǔ)上挑取疑似菌株P(guān)CR引物進行鑒定，在短時間內(nèi)快速確定病原菌株。傳統(tǒng)方法和分子生物學方法相結(jié)合，省去了生化試驗的步驟，同時比單純的分子生物學大范圍的篩選鑒定要節(jié)約很多試劑和時間，在生產(chǎn)實踐的一線更具有實際應用意義［9］。

本次病例發(fā)生的兔場相對規(guī)模較大，主要的疫苗如兔瘟疫苗、巴氏桿菌疫苗、產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗等均已經(jīng)按照防疫程序正常免疫，忽略了波氏桿菌疫苗的防疫，造成了本次疫情的發(fā)生。在管理良好的兔場，發(fā)生兔波氏桿菌一般較少，但是在天氣變化、飼養(yǎng)人員變動等應激條件下，若場內(nèi)有波氏桿菌的存在，則會導致兔群暴發(fā)該病。本病的預防措施主要是搞好環(huán)境衛(wèi)生，防止外來病原菌的入侵［10-11］。由于病原菌的入侵途徑的多樣化和不可預測性，不要存在僥幸心理過度相信廠區(qū)的管理水平，做好兔群波氏桿菌的正常防疫，提高飼養(yǎng)管理水平，減少兔群應激，降低條件性致病菌的發(fā)病概率［12-13］。

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