奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌的分離鑒定及藥敏試驗

胡文舉，宋艷畫，秦佳辰，石奎林，于文浩，劉遠哲，王新莊＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學，河南鄭州450002；2.河南廣播電視大學，河南鄭州450008；3.平頂山市郟縣紅牛繁育中心，河南平頂山467124；4.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南中牟451450）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后多發(fā)的一種生殖系統(tǒng)疾病?；疾r不僅影響奶牛的繁育性能，還可誘發(fā)其他疾病，重癥者可因此喪失經(jīng)濟價值而被淘汰，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。病原微生物感染是引發(fā)該病的最直接原因，但致病菌的種類和比例因地域、環(huán)境和飼養(yǎng)情況不同而有較大差異［1-2］。近年來，隨著平頂山地區(qū)奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率也呈現(xiàn)上升趨勢，但有關引起該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌種類及其耐藥性尚未見報道，給該病的防治造成很大困難。為此，本試驗對平頂山地區(qū)某奶牛場患病奶牛的致病菌進行了分離鑒定和藥敏試驗，為該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 選取經(jīng)臨床診斷及B超檢查確診患有子宮內(nèi)膜炎的河南平頂山地區(qū)某奶牛場共29頭奶牛，其中產(chǎn)后30d、31d～60d、61d～90d以及91d后患病的奶牛分別為11頭、9頭、4頭和5頭。昆明小鼠76只（22g／只～25g／只），其中雌小鼠40只，雄小鼠36 只，均購自河南省實驗動物中心。

1.1.2 藥品 阿莫西林、氨芐西林、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素等藥品均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 肉湯A 培養(yǎng)基、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂基礎培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、雙抗巧克力瓊脂培養(yǎng)基、改良沙瓊脂培養(yǎng)基、厭氧菌瓊脂、MH 肉湯均為青島高科園海博生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 用1g／L 高錳酸鉀對奶牛外陰部清洗消毒后，采用滅菌輸精管將適量滅菌生理鹽水注入子宮腔中，回抽子宮內(nèi)容物于含有2mL～3mL滅菌肉湯A 培養(yǎng)基的離心管中，低溫條件下立即帶回實驗室進行分離培養(yǎng)及相關檢測。

1.2.2 細菌的分離純化與鑒定 將采集到的樣品接入肉湯A 培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18h～24h后，分別劃線接種于血液瓊脂平板、雙抗瓊脂平板、改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基和厭氧瓊脂中繼續(xù)培養(yǎng)［3］。挑取生長狀態(tài)不同的單個菌落，革蘭染色、鏡檢，根據(jù)細菌的染色特性并結合菌落形態(tài)和生長特性，進行初步判斷和分類。然后分別接種到相應的培養(yǎng)基上進行純化和生化鑒定。

1.2.3 致病性試驗 將76只昆明小鼠隨機分成19組。第19組為對照組，其他各組腹腔內(nèi)分別注射1mL各種純化后的細菌懸液（約12×109cfu／mL）。攻毒后注意觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食和死亡情況。及時剖解死亡小鼠，選取心、肝、脾等臟器進行細菌分離鑒定，檢驗是否與攻毒菌株相一致。

1.2.4 藥敏試驗 將待試菌株制成懸液，用滅菌生理鹽水調(diào)整比濁度，使其達到0.5麥氏單位，然后用MH 肉湯按1∶1 000稀釋備用。用菌液將藥物按照兩倍稀釋法進行稀釋，使每行各孔的藥物濃度依次為：128、64、32、……0μg／mL，然后將96孔塑料板置于各菌株最佳培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)18h～24h。以無細菌生長孔內(nèi)所含抗菌藥物的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。每株細菌重復兩次，取其平均值。

1.2.5 藥敏試驗結果判定 各種菌株對不同藥物的耐藥、中介、敏感臨界值按照美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的數(shù)值標準進行判定［4］。藥敏試驗中未列入CLSI推薦范圍的部分抗菌藥物，藥敏試驗結果判斷參考同類藥物標準。

2 結果

2.1 細菌分離與鑒定結果

29份樣品中共分離出18種（52 株）細菌，有4份樣品未分離出細菌，細菌檢出率為86.21%。所分離出的細菌中革蘭陰性菌26株，占50.0%；革蘭陽性菌26株占50.0%；球菌10株，占19.2%；桿菌42株，占80.8%（表1～表3）。29例病例中有13例是由單一病原菌引發(fā)，占所有病例的44.8%；其中由蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的有7例，占單一感染病例的53.8%；由產(chǎn)堿假單胞菌引發(fā)的有3例，占單一感病例的23.1%。在混合感染病例中，奧斯陸莫拉菌、蠟樣芽胞桿菌和大腸埃希菌的檢出率較高，共檢出14株，占混合感染菌株數(shù)的35.9%。由此可見，該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要由蠟樣芽胞桿菌、奧斯陸莫拉菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、大腸埃希菌及產(chǎn)堿假單胞菌等細菌引起。

表1 奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的鑒定結果Table 1 The identification results of bacteria from cows with endometritis

表2 革蘭陽性菌生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of Gram-positive bacteria

表3 革蘭陰性菌生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of Gram-negative bacteria

2.2 小鼠致病性試驗結果

小鼠攻毒后12h內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、食欲不振等現(xiàn)象。其中大腸埃希菌組在攻毒12 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，24h該組小鼠全部死亡；而表皮葡萄球菌組、屎腸球菌組、乳房鏈球菌組和志賀菌屬組在攻毒后雖然小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振以及呼吸急促等癥狀，但48h后上述癥狀開始逐漸消失，72 h已基本恢復正常狀態(tài)，未見小鼠死亡病例（表4）。說明雖然分離到的細菌對小鼠均有不同程度的致病性，但葡萄球菌、屎腸球菌、乳房鏈球菌和志賀菌屬致病性較低，而大腸埃希菌、蘇云金芽胞桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、蠟樣芽胞桿菌和停乳鏈球菌致病性較強。

2.3 藥敏試驗結果

選擇檢出率高且致病力強的蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、奧斯陸莫拉菌、大腸埃希菌、停乳鏈球菌、蘇云金芽胞桿菌、產(chǎn)堿假單胞菌7種細菌進行體外藥敏試驗。由表5可見，7種細菌對阿莫西林和氨芐西林均表現(xiàn)為耐藥性，而對環(huán)丙沙星、恩諾沙星和強力霉素均高度敏感。

表4 昆明小鼠致病性試驗小鼠死亡情況Table 4 Death situation of pathogenicity test in Kunming mice

3 討論

引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的直接原因是產(chǎn)后各種病原微生物的感染，但感染病原微生物的種類和比例與地域、季節(jié)以及飼養(yǎng)管理水平密切相關，因此各個地區(qū)報道分離獲得的菌群種類和主要致病菌存在差異。本試驗中29頭病例共分離出18種（52株）細菌，其中有4頭病例未分離得到細菌，這可能是由于患病牛長期用藥導致子宮內(nèi)容物中細菌數(shù)量較少或非細菌感染引起的子宮內(nèi)膜炎。該地區(qū)子宮內(nèi)膜炎致病菌主要有蠟樣芽胞桿菌、奧斯陸莫拉菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、大腸埃希菌及產(chǎn)堿假單胞菌等。該結果與其他研究者報道結果有一定差異。陳星等［5］報道安徽地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌主要以鏈球菌為主，分離率為61.7%，其次為葡萄球菌分離率為29.8%；凌丁等［6］對南寧市郊子宮內(nèi)膜炎致病菌進行分離，結果表明葡萄球菌為最主要致病菌，檢出率為50%，其次為大腸埃希菌，檢出率為23.33%，與李正國［2］對新疆石河子地區(qū)分離的致病菌比例相類似；黃璐［7］研究認為，貴陽地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌主要為鏈球菌，檢出率達到74.1%，其次為大腸埃希菌檢出率為25.9%。造成這種差異可能與地域有關。本試驗29頭病例中單一細菌感染的有13頭，占病例總數(shù)的44.8%，說明該地區(qū)患牛主要以單一細菌感染為主。本試驗中12頭患牛子宮內(nèi)分離到蠟樣芽胞桿菌，占發(fā)病牛的48.0%，其中7 頭為單獨感染蠟樣芽胞桿菌；有6頭患牛子宮內(nèi)分離到奧斯陸莫拉菌；有5頭患牛子宮內(nèi)分離到大腸埃希菌，表明這3種細菌可能是導致該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌，因此在防治過程中應加以重視。產(chǎn)堿假單胞菌雖然只分離出3株，但是均為單一菌感染，在防治的過程中也不可忽視。

表5 分離菌株藥敏試驗結果Table 5 Drug sensitivity test results of isolated bacteria

致病性試驗表明，大腸埃希菌、腦膜膿毒性金黃桿菌、停乳鏈球菌、蘇云金芽胞桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌在腹腔攻毒后2d內(nèi)，均使本組昆明小鼠全部死亡。說明這5種細菌均有很強的致病性。攻毒蠟樣芽胞桿菌2d內(nèi)，有3只小鼠死亡，死亡率達75%，與李澆［8］、凌丁等［6］的研究結果一致，說明該菌株毒力較強。結合該菌株48%的檢出率，提示該菌是該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌。奶牛產(chǎn)后產(chǎn)道內(nèi)有一定的創(chuàng)傷，來源于場舍環(huán)境中的蠟樣芽胞桿菌可通過創(chuàng)傷部位感染機體，當機體免疫力低下時，可引起發(fā)病［9］。因此，在奶牛圍產(chǎn)期應注意產(chǎn)房衛(wèi)生，定期對產(chǎn)房進行消毒，同時要加強飼養(yǎng)管理，提高奶牛的抗病能力。

藥敏試驗結果顯示，蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希菌、蘇云金芽胞桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、奧斯陸莫拉菌、停乳鏈球菌、產(chǎn)堿假單胞菌都對阿莫西林和氨芐西林有耐藥性。這可能與該牛場頻繁使用這2種藥物，使細菌產(chǎn)生耐藥性有關，治療時建議盡量不使用；對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強力霉素均高度敏感，可做為該地區(qū)治療子宮內(nèi)膜炎的首選藥物。

引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌比較復雜，與地域、環(huán)境、季節(jié)關系密切，同一牛場不同季節(jié)，致病菌也可能不同。因此，定期進行細菌的分離鑒定和藥敏試驗，確定致病菌種類，選擇最敏感的藥物，才能夠達到最佳治療效果［10］，防止抗菌藥物濫用使病原微生物產(chǎn)生交叉耐藥性。奶牛一旦患有子宮內(nèi)膜炎，就會給生產(chǎn)帶來較大損失，因此奶牛子宮內(nèi)膜炎防重于治。奶牛子宮內(nèi)膜炎的直接病因就是產(chǎn)后各種病原微生物的感染，在分娩和產(chǎn)后，奶牛體抗力較弱，產(chǎn)道存在創(chuàng)傷，環(huán)境中病原微生物易侵入造成子宮感染。因此，在實際生產(chǎn)中應加強飼養(yǎng)管理，增強奶牛的免疫力，定期對環(huán)境進行消毒，減少致病菌的傳播，才能降低子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率。

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