二甲基亞砜對豬精液冷凍保存效果研究

馬 麗，李青旺，吳民耀＊

（1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

豬精液冷凍技術(shù)是指用干冰（-79℃）、液氮（-196℃）等作為冷源，將精液經(jīng)過稀釋、平衡等特殊處理后，保存在極低溫度下，抑制其新陳代謝，一旦升溫后精子能夠復(fù)蘇，又不失去受精能力［1］。在豬精液冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑在精液冷凍保存過程中，對精子的冷凍效果至關(guān)重要［2］。自從人們發(fā)現(xiàn)甘油對精子具有冷凍保護(hù)作用后，家畜精液冷凍技術(shù)得到迅速發(fā)展［3］。卵黃與甘油是豬精液冷凍保存最常用的抗凍劑，卵黃是保護(hù)精子抵抗冷休克最有效的抗凍劑［4］，一般甘油使用的最終濃度通常是30mL／L，由于較高濃度的甘油具有潛在的化學(xué)與滲透毒性作用［5］，因此有必要尋找比甘油毒性更低的抗凍劑。

二甲基亞砜（DMSO）作為一種含硫的有機(jī)化合物，是一種非質(zhì)子極性溶劑，并且毒性極低，被稱為“萬能溶媒”和“萬能藥”，它作為藥物輔助治療劑、細(xì)胞冷凍保護(hù)劑、生物膜融合劑和膜滲透劑，已被廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，這些應(yīng)用大部分都與DMSO 具有增加生物膜通透性的能力密切相關(guān)［6］。有報道稱不同類型的細(xì)胞使用DMSO 作冷凍保護(hù)劑所得到細(xì)胞存活率差異很大［7-11］。研究人員MilioriniA B等［12］，Penaranda D S等［13］，He S等［14］認(rèn)為二甲基亞砜在魚類精子冷凍保存中有好的效果。SiWei［15］等認(rèn)為二甲基亞砜在稀有動物和地方品種中的精子冷凍保存中起到較好效果。但二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑在豬精液冷凍方面卻報道較少。本研究用二甲基亞砜（DMSO）替代甘油，與3 mL／L的甘油作對比，以凍后精子活率、畸形率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率作為評價指標(biāo)，確定DMSO 最適添加量。同時，研究DMSO 與甘油不同配伍（4∶1、3∶2、3∶1、1∶1和2∶3）的混合冷凍保護(hù)劑，對豬精液冷凍保存的效果的影響，旨在篩選出最佳配伍，為生產(chǎn)實踐提供參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與藥品 電子分析天平（HANGPING，F(xiàn)A2004N）；高速冷凍離心機(jī)（聯(lián)想科技有限公司，Allegra 64R）；雙筒光學(xué)顯微鏡（XSZ-G）；超凈水機(jī)（聯(lián)想科技有限公司，CluvFB273101）；17℃恒溫箱（XMT-A7000）；程序冷凍儀（CL-8800）；電熱干燥箱（科偉101-3AB）；0.25 mL 卡蘇凍精管（STO）；4℃冰箱（海爾，BCD-186YH）；DMSO（西安試劑廠）；甘油（成都化學(xué)試劑廠）；姬姆薩染料（南京生興生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 稀釋液及溶液配制 配制常溫保存BTS：準(zhǔn)確稱取葡萄糖3.7g，EDTA 0.125g，檸檬酸三鈉0.6g，碳酸氫鈉0.125g，氯化鉀0.007 5g，青霉素鈉0.06g，硫酸鏈霉素0.1g，加雙蒸水至100mL，調(diào)pH 至7.25。

TCG 冷凍基礎(chǔ)液：準(zhǔn)確稱取葡萄糖1.1g，檸檬酸1.48g，Tris 2.42g，青霉素鈉0.06g，硫酸鏈霉素0.1g，加雙蒸水至100mL，調(diào)pH 至6.21。

冷凍稀釋液：在80 mL TCG 冷凍基礎(chǔ)液中加入20mL新鮮卵黃，攪拌均勻，即為Ⅰ液。再按試驗要求添加適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)的甘油和DMA 配成Ⅱ液。

果糖-檸檬酸鈉低滲液：果糖0.675 6g，檸檬酸三鈉0.367 6g，加蒸餾水至50mL。

姬姆薩染劑：取姬姆薩染料（南京生興生物技術(shù)有限公司）0.59g；甲醇（西安三浦精細(xì)化工廠）35 mL。先將染料置于甘油中60℃水浴2h，使其溶解，然后加入60 ℃預(yù)熱的甲醛，混合后置棕色瓶內(nèi)放置備用。

1.2 方法

1.2.1 采精 本試驗所用精液采自武功縣三佳種豬場，選擇1.5歲～2 歲體格健壯、性欲旺盛的10頭種公豬。用手握法采精，選擇中段濃厚部分精液，經(jīng)4層消毒紗布過濾除去膠狀物，在37℃條件下用顯微鏡進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢測，選擇無異味、色澤為乳白色、精子形態(tài)正常、活率在0.8以上且形態(tài)學(xué)完整率大于900mL／L 的精液用于試驗，裝在經(jīng)過37℃預(yù)熱的保溫瓶中并在1h之內(nèi)送回實驗室。

1.2.2 精液冷凍與處理 將合格的精液運(yùn)回實驗室后，用10mL離心管等量分裝，離心（37℃，1 600 r／min，5min），棄上清，加入等量預(yù)熱的BTS，經(jīng)12層～15層紗布包裹后，在17℃恒溫箱中平衡3h，同時，將Ⅰ液在冷 凍離心 機(jī) 中 離 心（17℃，2 000 r／min，15min）。將平衡處理過的精液用10mL 離心管分裝，在高速冷凍離心機(jī)內(nèi)離心（17℃，2 400 r／min，3min），棄上清，加入等溫離心過Ⅰ液（1∶1稀釋），用12～15層紗布包裹后置于4℃冰箱中平衡2h，將離心后的精液，與等溫Ⅰ液等量混合并輕輕搖勻，用毛巾包裹后放入4℃冰箱，靜置2h。同時，將Ⅱ液和最終所用容器（10mL 離心管）也放入4℃冰箱，進(jìn)行以下兩個試驗：①將加入Ⅰ液并在4℃冰箱中平衡2h后的精液均勻分為11份，分別加入等溫的Ⅱ液（1∶1稀釋，調(diào)整精子密度為1.0×109個／mL），并使甘油最終添加量為30 mL／L，作為對照組；DMSO 最終添加量分別為40、50、60、70、80mL／L，此外，將DMSO 和甘油配伍（4∶1，3∶1，3∶2，1∶1和2∶3）成最終濃度為3%的混合冷凍保護(hù)劑，并分別記作A、B、C、D 和E 組，一并作為試驗組，4℃冰箱平衡2h。靜置后，對精液進(jìn)行凍前鏡檢，并記錄。本試驗采用細(xì)管冷凍。用專用注射器將精液吸入0.25mL細(xì)管內(nèi)（法國進(jìn)口），快速封管，置于程序冷凍儀中以1℃／min 的速率從4℃緩慢降至-6℃，迅速移至液氮上方3cm 處，熏蒸15min，將細(xì)管放入液氮中保存。

1.2.3 解凍后精液品質(zhì)檢測

1.2.3.1 精子活率 將細(xì)管凍精取出后立即放入37℃的水浴中解凍30s，收集于試管內(nèi)，然后用等溫的解凍液（95%BTS常溫保存液＋5%相應(yīng)的Ⅰ液）孵育5 min，取10μL 精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400×顯微鏡下評價精子活率（直線運(yùn)動精子百分率）。每次至少檢測200個精子，重復(fù)10次。

1.2.3.2 畸形率 凡精子頭、頸和尾任一部位發(fā)生畸形的精子均計為畸形精子。每次至少檢測200個精子，重復(fù)10次，畸形率＝（畸形精子數(shù)／計數(shù)精子總數(shù)）×100%。

1.2.3.3 精子質(zhì)膜完整率 精子質(zhì)膜完整率采用周佳勃等2005年報道的方法，以果糖-檸檬酸鈉低滲液進(jìn)行低滲腫脹檢測（HOST）。將解凍的精液用低滲液稀釋，調(diào)整精子密度為1×106個／mL，37℃孵育30min，取20μL 精液懸液滴于血細(xì)胞計數(shù)板上，在400×顯微鏡下觀察，計算彎尾精子百分率，每次至少檢測200個精子，重復(fù)10次。

1.2.3.4 頂體完整率 頂體完整率采用蘇昀等1999年的報道方法，取解凍后的精液5μL 滴于載玻片上，涂片后自然風(fēng)干，甲醇固定3min～5min。配好的染色液用磷酸緩沖液稀釋10倍～20倍。固定好的涂片用染液浸染5 min；染好的涂片用蒸餾水沖洗晾干，用油鏡每次至少檢測200個精子，重復(fù)10次。

根據(jù)頂體外形和損傷情況將精子頂體分為四種類型：Ⅰ型：頂體完整，精子外型正常，著色均勻，頂體邊緣整齊。Ⅱ型：頂體輕微腫脹，質(zhì)膜（頂體膜）疏松膨大。Ⅲ型：頂體破壞，精子質(zhì)膜嚴(yán)重膨脹破損，著色淺，邊緣不整齊。Ⅳ型：頂體全部脫落，精子核裸露。

Ⅰ、Ⅱ型視為頂體完整；Ⅲ型、Ⅳ型視為頂體不完整。精子頂體完整率計算公式如下：精子頂體完整率＝頂體完整精子數(shù)／計數(shù)精子總數(shù)×100%

1.2.4 統(tǒng)計分析采用IBM-SPSS 19.0軟件One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析和LSD 多重比較分析，數(shù)據(jù)以Mean±SEM 表示。

2 結(jié)果

2.1 不同DMSO及混合冷凍保護(hù)劑的添加量對解凍后精子活率和畸形率的影響

DMSO 各添加組、混合冷凍保護(hù)劑各添加組及對照組凍前活率差異不顯著（P＞0.05）。30mL／L甘油對照組的凍后活率最高，顯著高于DMSO 添加組和混合冷凍保護(hù) 劑各 添加組（P＜0.05），60 mL／L DMSO 添加組的凍后活率均顯著高于40、50、70、80mL／L DMSO 添加組（P＜0.05），畸形率顯著低于40、50、70、80mL／L DMSO 添加組（P＜0.05），且40、50、70、80mL／L DMSO 添加組間凍后活率和畸形率差異不顯著（P＞0.05）。B 組的凍后活率顯著高于A、C、D、E 組和DMSO 各添加組（P＜0.05），畸形率顯著低于40、50、70、80mL／L DMSO 添加組、C、D、E 和對照組（P＜0.05），但與60 mL／L DMSO、A 組間差異不顯著（P＞0.05）。A組的凍后活率顯著高于40、50、70、80mL／L DMSO添加組、D 組、E組，但與60mL／L DMSO 添加組、C組間差異不顯著（P＞0.05）。D組、E 組與40、50、70、80mL／L DMSO 添加組間凍后活率差異不顯著（P＞0.05），且D組、E組、40、50、60、70、80 mL／L DMA 添加組及對照組間畸形率差異不顯著（P＞0.05）。這表明DMSO 添加組的活率雖然不及30 mL／L甘油對照組，但畸形率比對照組低且差異不顯著（P＞0.05），這可能是由于甘油比DMSO 的毒性大。B組的凍后活率顯著高于DMSO 各添加組，且畸形率顯著低于DMSO 添加組及對照組，這表明按一定比例混合甘油和二甲基亞砜能有效減少畸形率（表1）。

2.2 不同DMSO及混合冷凍保護(hù)劑的添加量對解凍后精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率的影響

由表2知，60mL／L DMSO 添加組的頂體完整率和質(zhì)膜完整率均顯著高40、50、70、80mL／L DMSO 添加組及30 mL／L 甘油添加組（P＜0.05）。40、50、60、70、80mL／L DMSO 添加組和30mL／L甘油添加組間頂體完整率和質(zhì)膜完整率均差異不顯著（P＞0.05）。B 組的頂體完整率和質(zhì)膜完整率均顯著高于40、50、70、80 mL／L DMSO 添加組、A組、C 組、D 組、E 組和3%甘油添加組，但與60 mL／L DMSO 添加組間頂體完整率和質(zhì)膜完整率均差異不顯著（P＞0.05）。40、50、70、80 mL／L DMSO 添加組、A組、C組和D組間頂體完整率 和質(zhì)膜完整率均差異不顯著（P＞0.05），但與E 組的頂體完整率差異顯著（P＜0.05），質(zhì)膜完整率差異不顯著（P＞0.05）。這說明DMSO 添加組較30 mL／L甘油對照組能顯著提高凍后精子的頂體完整率和質(zhì)膜完整率，且混合冷凍保護(hù)劑對精子的頂體和質(zhì)膜均有較好的保護(hù)作用。

表1 不同DMSO及混合冷凍保護(hù)劑的添加量對解凍后精子活率和畸形率的影響Table 1 The effects of different addition of DMSO and mixed cryoprotectants on frozen-thawed sperm motility and sperm abnormal rate

表2 不同DMSO及混合冷凍保護(hù)劑的添加量對解凍后精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率的影響Table 2 The effects of different addition of DMSO and mixed cryoprotectants on frozen-thawed sperm acrosomes integrity and plasma membrane integrity

3 討論

3.1 精子保存溫度對其品質(zhì)影響

豬精子對低溫打擊和冷凍非常敏感，在冷凍-解凍過程中，冰晶對精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械性損傷和精子細(xì)胞脫水引起的溶液性損傷是導(dǎo)致精子損傷的兩個主要因素。冷凍時，細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶造成冷凍的物理損傷，損傷的程度最終由降溫速率和冷凍的最終溫度來決定。然而，細(xì)胞內(nèi)形成冰晶是不可避免的，關(guān)鍵看所形成的冰晶的大小和數(shù)量，只有大冰晶可以造成精細(xì)胞的物理性損傷，如果僅維持在微晶狀態(tài)，細(xì)胞就不會受到損傷。豬精子在迅速冷卻時易失去活率，尤其是在精液采集后迅速冷卻至15℃，以及至5℃和0℃，易發(fā)生冷休克。精子抗冷休克的能力受精子膜上膽固醇和磷脂的比例、烴鏈的飽和程度、蛋白質(zhì)和磷脂的比例等的影響。因為豬精子膜磷脂酰膽堿的含量較低，精子膜上膽固醇／磷脂的比例較低，且膽固醇的分布量外膜大于內(nèi)膜，使得內(nèi)膜對冷休克特別敏感。所以，豬精子冷凍解凍后更容易表現(xiàn)出精子活率喪失，精子膜選擇通透性降低，頂體膜損傷等問題。

3.2 精子冷凍保護(hù)劑作用及機(jī)理

自波爾等報告了甘油對細(xì)胞冷凍保存有利后，甘油一直被廣泛用來作為冷凍保存細(xì)胞的方法，包括哺乳動物的精子。甘油作為冷凍保護(hù)劑，具有滲透性導(dǎo)致膜脂和蛋白的重排，促進(jìn)了細(xì)胞膜的流動性和離子通透性，也使ATP 的消耗增加，甘油能在較低溫度下使細(xì)胞更少的脫水，因此提高了冷凍保存細(xì)胞的活率。但是，甘油稀釋液也導(dǎo)致精子滲透性的損傷及其毒副作用，甘油改變了精子雙層膜結(jié)構(gòu)，破壞了精子頂體完整性及蛋白質(zhì)和糖蛋白的凝結(jié)結(jié)合。雖然甘油有一些副作用，但甘油仍然被普遍使用于精液冷凍保存中，自洛夫洛克等首次報道二甲基亞礬（DMSO）在紅細(xì)胞冷凍保護(hù)中優(yōu)于甘油，DMSO 單獨或與其他冷凍保護(hù)劑組合被廣泛用作冷凍保護(hù)劑。但在豬精液冷凍保存中，還少有人報道。

二甲基亞砜和甘油均為滲透性冷凍保護(hù)劑，但它們的冷凍保護(hù)機(jī)理卻不盡相同。二甲基亞礬由于其分子量較低，它在細(xì)胞中能快速進(jìn)行滲透，因此使精子快速脫水減少細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。DMSO 可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，使細(xì)胞內(nèi)水分不會過分外滲，避免細(xì)胞過分脫水皺縮。DMSO 還是羥自由基的清除劑，而羥自由基是一個極其活潑的氧化劑，可由超氧陰離子和過氧化氫經(jīng)Haber-weiss或Fenton 反應(yīng)生成，對細(xì)胞損害嚴(yán)重。而甘油屬于醇類化合物，含有3個羥基，每個甘油分子可從水分子中結(jié)合6個氫，在豬精液冷凍過程中，甘油的最適添加量一般為30 mL／L。因為高添加量的甘油對精子細(xì)胞具有潛在的毒性作用，而且甘油的羥自由基可能會在分子內(nèi)或分子間結(jié)合，這樣就導(dǎo)致溶液黏滯性增加，不利于甘油與水分子的結(jié)合。

3.3 精子冷凍復(fù)合保護(hù)劑效果

本試驗用DMSO 完全代替甘油，結(jié)果表明DMSO 凍后活率不及甘油，可能高濃度DMSO 有較強(qiáng)的毒副作用，但畸形率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率在豬精液冷凍保存方面優(yōu)于30mL／L 甘油，且最適合添加量為60mL／L；可見不同的保護(hù)劑各有優(yōu)勢所在。在混合冷凍保護(hù)劑方面，750mL／L 甘油與250 mL／L二甲基亞砜的配伍，取得了在凍后活率上優(yōu)于DMSO 添加組的效果，且畸形率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率優(yōu)于30 mL／L 甘油對照組，所以750 mL／L甘油與250mL／L 二甲基亞砜的配伍成最終濃度為30mL／L 的混合冷凍保護(hù)劑在豬精液冷凍保存上取得較好的效果。二甲基亞砜雖然可以降低精子畸形率，提高頂體／質(zhì)膜完整率，但其解凍后精子活率有所下降，在生產(chǎn)實踐中只要掌握好加了保護(hù)劑授精液用量，不會影響家畜正常受孕，還需要進(jìn)一步在今后大量生產(chǎn)實踐中觀察和驗證。二甲基亞砜對豬精液冷凍保護(hù)的機(jī)制還不太清楚，也有待進(jìn)一步研究。弄清冷凍過程中精子內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生的變化，探討影響精子冷凍后存活的內(nèi)外因素，以期能夠篩選出更有效的精液保存方法。

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