烏鱧致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

康元環(huán)，孟慶峰，夏京津，龍繼兵，盛宇軒，陳 龍，單曉楓＊，錢愛東＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林長(zhǎng)春130062）

烏鱧（Channa argus）俗稱才魚、墨魚、烏魚，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值與營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)價(jià)值均較高的淡水名貴魚類。其味美肉鮮，蛋白含量較高，且具有去瘀生新、健脾利水等醫(yī)療功效，受到了廣大消費(fèi)者的推捧。目前，烏鱧已成為特種養(yǎng)殖品種一族，其養(yǎng)殖規(guī)模也在逐年擴(kuò)大。但由于養(yǎng)殖的集約化，在養(yǎng)殖過(guò)程中有一部分養(yǎng)殖戶缺乏對(duì)傳染病有效控制的理念，致使烏鱧各種細(xì)菌性病害逐漸嚴(yán)重，制約了烏鱧養(yǎng)殖業(yè)健康而且可持續(xù)發(fā)展［1］。2010 年6～8 月間，吉林省某烏鱧養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的烏鱧出現(xiàn)大量死亡，病魚主要表現(xiàn)為體表有大量出血點(diǎn)，鰭條充血，肛門紅腫，剖檢可見主要組織臟器有出血點(diǎn)，腸道充血。從病死魚體內(nèi)分離到一株致病性病原菌，經(jīng)理化特性、16SrRNA 序列分析，對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定；同時(shí)對(duì)該菌的耐藥性進(jìn)行了分析，并對(duì)其攜帶的部分毒力基因進(jìn)行了驗(yàn)證，為該菌引發(fā)的疾病的防治提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 病魚采自吉林省某烏鱧養(yǎng)殖場(chǎng)患病魚；健康烏鱧由吉林省某養(yǎng)殖場(chǎng)提供，體重150 g左右。

1.1.2 主要試劑 RS瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 致病菌的分離 取患病的烏鱧，無(wú)菌操作，取肌肉、心血等組織，劃線接種于RS瓊脂平板級(jí)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病菌的人工感染試驗(yàn) 將菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28℃震蕩培養(yǎng)16h～18h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度。用無(wú)菌生理鹽水稀釋至2.43×107cfu／mL的菌懸液，試驗(yàn)組腹腔注射接種健康烏鱧，每尾注射劑量0.3mL，對(duì)照組注射0.3mL 無(wú)菌生理鹽水，每組各注射9尾，水溫保持22℃左右。持續(xù)觀察7d，記錄試驗(yàn)烏鱧發(fā)病與死亡情況，同時(shí)對(duì)人工感染的病死魚進(jìn)行病原菌再分離，觀察再次分離菌株在形態(tài)及理化特性是否與原分離菌株一致。

1.2.3 菌體形態(tài)觀察及主要理化特性的測(cè)定 將純化的病原菌28℃培養(yǎng)16h～18h后，革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。另取純培養(yǎng)物接種于生化反應(yīng)管中，具體操作以微量生化反應(yīng)管說(shuō)明書為參照。

1.2.4 16 SrRNA 鑒定及基因序列分析 分子生物學(xué)操作以參考文獻(xiàn)［2］為參照進(jìn)行，引物為細(xì)菌通用引物（表1）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收純化，引物合成與測(cè)序由華大公司完成。菌株16SrRNA 基因序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列相似性比較，使用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行分析。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用涂布法將一定濃度致病菌菌液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，貼上藥敏紙片，28℃培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.6 致病菌部分毒力基因的檢測(cè) 依據(jù)已發(fā)表致病菌的幾種毒力基因序列，并參照其他文獻(xiàn)［3-4］，設(shè)計(jì)并合成引物。引物退火溫度、擴(kuò)增目的片段大小如表1所示。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及菌體形態(tài)

從病死魚體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株，暫命名WL161。該菌株為革蘭陰性菌，28℃培養(yǎng)16h～18 h后，菌體呈多形性，長(zhǎng)絲狀與短桿狀并存，散在，短桿狀兩端鈍圓，無(wú)芽胞。該菌株?duì)I養(yǎng)瓊脂上菌落呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，白色，不甚透明，在RS瓊脂上菌落呈圓形、光滑濕潤(rùn)，菌落呈黃色。

2.2 人工感染試驗(yàn)

將菌株WL161腹腔接種于健康烏鱧，在7d內(nèi)大部分死亡（7／9），全部發(fā)病，對(duì)照組無(wú)異常。將病死魚剖檢，病癥及眼觀病理變化與自然發(fā)病魚相同，從中分離出與WL161形態(tài)和理化特性相同的細(xì)菌。

2.3 主要理化特性

菌株WL161的理化特性如表2所示。結(jié)合菌落與菌體特征，參照文獻(xiàn)［5］，初步判定細(xì)菌WL161為維氏氣單胞菌。

表1 PCR反應(yīng)的引物序列和目的片段大小Table 1 The primer sequences and length of target fragments

表2 分離菌的理化特性Table 2 Physicochemical properties of the isolates

2.4 16SrRNA基因序列分析結(jié)果

以菌株WL161的基因組模板，通過(guò)16SrRNA通用引物，擴(kuò)增出長(zhǎng)度約1 500bp的片段（圖1），將該基因序列用Blast軟件進(jìn)行相似性比較，與維氏氣單胞菌16SrRNA基因序列相似性為99.5%，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），發(fā)現(xiàn)菌株WL161與A.veronii處于同一進(jìn)化分支。

2.5 藥敏試驗(yàn)

菌株WL161對(duì)單環(huán)菌素、利福平、呋喃妥因、氯霉素、阿奇霉素、頭孢克肟、頭孢曲松鈉、氟哌酸、恩諾沙星、奧復(fù)星、復(fù)方新諾明等藥物呈現(xiàn)高度敏感；對(duì)克林霉素、紅霉素、丁胺卡那、新生霉素、環(huán)丙氟哌酸、多黏菌素B等藥物中度敏感；對(duì)萬(wàn)古霉素、青霉素G、氨芐青霉素等藥物耐藥。

2.6 致病菌部分毒力基因的檢測(cè)

經(jīng)PCR檢測(cè)，維氏氣單胞菌WL161株攜帶多種毒力基因（圖1）。

圖1 16SrRNA 基因及其毒力基因Aha、LuxS、aer、ser、act擴(kuò)增Fig.1 PCR detection results of Aha，LuxS，aer，ser，act and 16SrRNA genes

3 討論

維氏氣單胞菌是氣單胞菌屬的一個(gè)種，廣泛存在于水環(huán)境、土壤及動(dòng)物消化道中，該菌不同菌株的毒力有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)毒株除感染人類并引發(fā)疾病外，還可感染多種水生動(dòng)物且病例逐年增多，已逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害較大的病原菌［6-10］。本研究從患病烏鱧體內(nèi)分離出一株致病菌，經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，證明其對(duì)烏鱧有較強(qiáng)的致病力。經(jīng)菌落形態(tài)、理化特性及16SrRNA 測(cè)序，鑒定為維氏氣單胞菌。該菌的菌體形態(tài)在人工培養(yǎng)18h 后，經(jīng)革蘭染色觀察，發(fā)現(xiàn)其具有多形性——即短桿狀與長(zhǎng)絲狀并存，這并未在其他發(fā)表文獻(xiàn)中提及，但本實(shí)驗(yàn)室在幾十株不同源性維氏氣單胞菌菌體形態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，多形性是一種普遍現(xiàn)象，有別于其他氣單胞菌，是否可以認(rèn)為，菌體多形性是維氏氣單胞菌特性，仍需更多菌株驗(yàn)證。

強(qiáng)毒力的維氏氣單胞菌可以產(chǎn)生多種毒力因子，如氣溶素、絲氨酸蛋白酶、腸毒素等。經(jīng)PCR檢測(cè)，菌株WL161攜帶多種毒力基因，其動(dòng)物回歸試驗(yàn)也證實(shí)，該菌株的致病性較強(qiáng)，說(shuō)明菌株攜帶毒力因子的多少與致病性強(qiáng)弱有一定相關(guān)性。本研究還從菌株WL161中檢測(cè)到密度感應(yīng)調(diào)控基因LusX，而密度感應(yīng)系統(tǒng)的存在，對(duì)細(xì)菌的耐藥性和毒力都有一定的影響［11-13］，但LusX 具體調(diào)控維氏氣單胞菌何種基因，仍有待于深入研究。

圖2 基于16Sr RNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis based on 16Sr RNA sequences

［1］吳同壘，單曉楓，王桂芹，等.烏鱧主要病害的研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，17（9）：29-31.

［2］薩姆布魯克，拉賽爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：387-392.

［3］Nawaz M，Khan S A，Khan A A，et al.Detection and characterization of virulence genes and integrons inAeromonas veroniiisolated from catfish［J］.Food Microbiol，2010，27（3）：327-331.

［4］胡天野，吳同壘，孟慶峰，等.框鏡鯉維氏氣單胞菌的生物學(xué)特性［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（8）：18-21.

［5］George M，Julia A，Timothy G，et al.Bergey＇s manual of systematic bacteriology［M］.2nd.New York：Springer，2005：425-437.

［6］吳同壘，單曉楓，孟慶峰，等.維氏氣單胞菌研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，45（7）：41-44.

［7］王 旭，顏其貴，陳 玥，等.中國(guó)大鯢維氏氣單胞菌病的組織病理學(xué)觀察［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（7）：737-740.

［8］Chen J H，Zhu N Y，Kong L，et al.First case of soft shell disease in Chinese soft-shelled turtle（Trionyx sinens）associated withAeromonas sobria-A.veroniicomplex［J］.Aquaculture，2013，406-407（8）：62-67.

［9］常 燕，王兆慧，劉思園，等.暗紋東方鲀致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（3）：629-632.

［10］朱成科，向 楨，葉 華，等.黃顙魚致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，35（5）：37-42.

［11］Han X G，Bai H，Liu L，et al.The luxS gene functions in the pathogenesis of avian pathogenicE.coli［J］.Microb Pathog，2013，55（2）：21-27.

［12］Wang Y，Zhang W，Wu Z F，et al.Functional analysis of luxS inStreptococcus suisreveals a key role in biofilm formation and virulence［J］.Vet Microbiol，2011，152（1-2）：151-160.

［13］Xue T，Zhao L P，Sun B L.LuxS／AI-2system is involved in antibiotic susceptibility and autolysis inStaphylococcus aureusNCTC 8325［J］.Int J Antimicrob Agent，2013，41（1）：85-89.