基于微衛(wèi)星標記的不同地區(qū)烏鱧和白化烏鱧群體遺傳多樣性研究

張 露,樊 威,蘇 建,焦曉磊,周 劍,黃志鵬,趙 瀚,趙仲孟,段元亮,李 強,杜 軍,卓 婷,蘇全森,吳 俊,羅 煜

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，成都 611731； 2. 四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 內(nèi)江 641199)

【研究意義】烏鱧(Channaargus)是鱧科魚類中分布最廣、產(chǎn)量最大的種類[1]，廣泛分布于長江流域以及北至黑龍江一帶，而白化烏鱧主要分布在嘉陵江中下游流域。烏鱧身上花紋黑白相間，生性兇猛，繁殖力極強，白化烏鱧體形和生活習性等與普通烏鱧相同，但白化烏鱧體色呈較單一的白色或灰白色[2]；烏鱧和白化烏鱧都具有生長速度快、適應(yīng)性強、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、少刺等特點，且白化烏鱧還具有一定的藥用價值，深受消費者喜愛[3]。隨著烏鱧和白化烏鱧市場需求量的不斷增大，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷增大，但部分烏鱧和白化烏鱧養(yǎng)殖群體仍存在個體表型差異較大、遺傳背景不清楚等問題，對烏鱧和白化烏鱧遺傳多樣性的研究可以為其種質(zhì)資源保護和選育提供科學(xué)依據(jù)。【前人研究進展】烏鱧和白化烏鱧曾被認為是2個不同的物種，后來有研究通過對兩者的形態(tài)特征、乳酸脫氫酶、酯酶同工酶、染色體類型和線粒體等進行了多方面的比較，認為白化烏鱧不能被劃分為單獨的亞種，應(yīng)視為普通烏鱧的白化變種[4]。目前對白化烏鱧的研究主要集中在繁育技術(shù)[5]、養(yǎng)殖管理[3, 6]、染色體核型[7]、疾病防治[8-9]和營養(yǎng)成分[2, 10]等方面，對于現(xiàn)有白化烏鱧資源的遺傳多樣性的研究相對較少。微衛(wèi)星標記具有中性、共顯性和高度多態(tài)等特點，是非常適合用于群體遺傳研究的分子標記[11]。微衛(wèi)星標記作為種群遺傳分析最有效的分子標記之一，被廣泛運用于以飄魚、黃顙魚、花鱸等為代表的魚類群體遺傳多樣性研究[12-14]。近年來，已有許多烏鱧微衛(wèi)星標記開發(fā)及利用的研究報道，其中Gul等[15]從烏鱧基因組文庫中分離出了10個二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點；King等利用磁珠捕獲技術(shù)從烏鱧中獲得了19個四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點[16]；溫曉曦等[17]利用磁珠富集法結(jié)合放射性同位素雜交方法分離烏鱧的微衛(wèi)星分子標記，并報道了19個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，包括3個二堿基重復(fù)和16個三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點；隨后Yan等[18]通過FIASCO法構(gòu)建烏鱧微衛(wèi)星文庫，篩選到了18個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，包括1個二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點和17個四堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點，這些標記的開發(fā)為烏鱧遺傳多樣性的研究提供了基礎(chǔ)。微衛(wèi)星標記已被應(yīng)用于烏鱧養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性研究，有研究分別采用10和14個烏鱧微衛(wèi)星標記對我國不同地理位置的烏鱧養(yǎng)殖群體遺傳多樣性進行了研究，并分析了現(xiàn)有烏鱧養(yǎng)殖群體間的遺傳距離，為烏鱧的選育提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[19-20]。然而目前對于利用微衛(wèi)星標記對不同地區(qū)白化烏鱧群體的研究還鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】為探明白化烏鱧與烏鱧養(yǎng)殖群體遺傳多樣性，本研究采用20個微衛(wèi)星標記對不同地理位置的烏鱧和白化烏鱧群體微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性和遺傳分化特征進行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬為烏鱧和白化烏鱧群體的遺傳資源保護及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA提取

7個不同地理位置的4個烏鱧群體和3個白化烏鱧育成群體的樣本采集信息見表1。采集肌肉或鰭條組織樣本，用90%的酒精保存待用。采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取樣本DNA，提取方法按照試劑盒說明書操作。提取的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 烏鱧和白化烏鱧群體樣本采集信息Table 1 Sampling locations and information for Channa argus and Albino Channa argus populations populations

1.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

采用前人開發(fā)的20對烏鱧微衛(wèi)星引物(表2)對所有群體進行PCR擴增[16, 18]。PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2×TaqPCR Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司)、1 μL模版DNA、上下游引物各1 μL、9.5 μL ddH2O。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，進行35個循環(huán)擴增(95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。STR基因分型和引物合成均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 用于本研究的微衛(wèi)星引物相關(guān)信息Table 2 Primers used in the present study

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用CERVUS 3.03[21]進行哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)檢驗，并計算等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)。利用Arlequin 3.5[22]進行分子方差分析(AMOVA)和遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)ST)分析，并使用MEGA 5.0[23]軟件基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建UPMGA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點多態(tài)性

如表3所示，所有20對微衛(wèi)星引物共檢測出356個等位基因，Na介于4～40，每個位點平均有17.8個等位基因。Ho介于0.000～0.791，平均值為0.578；He介于0.310～0.910，平均值為0.732；PIC值介于0.271～0.901，平均值為0.700，其中16個位點均具有高度多態(tài)性(PIC>0.5)，位點CarA118、CarC104、CarC116和CA04多態(tài)性相對較低。哈迪溫伯格平衡檢驗(HWE)顯示位點CarA118和CarC104未顯著偏離哈迪溫伯格平衡，其他位點均顯著偏離哈迪溫伯格平衡。

表3 微衛(wèi)星位點遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters among 16 loci of Channa argus and Albino Channa argus populations

2.2 群體遺傳多樣性

對4個烏鱧和3個白化烏鱧群體的遺傳多樣性分析結(jié)果(表4)顯示，7個群體的Na為3.45～13.90，Ho為0.399～0.757，He為0.397～0.785，PIC值為0.344～0.753，其中HZ群體PIC值最高，且所有烏鱧群體的Na、Ho、He、PIC均高于白化烏鱧群體。

表4 烏鱧和白化烏鱧群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Channa argus and Albino Channa argus populations

2.3 群體的遺傳分化

7個群體的遺傳分化指數(shù)FST在0.07876～0.4030(表5)，所有群體間的遺傳分化均達顯著水平(P<0.05)。3個白化烏鱧群體間的FST值為0.08 785～0.12 342，4個烏鱧群體間的FST值為0.07 876～0.17 185，白化烏鱧和烏鱧群體間的FST

表5 不同群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)Table 5 fixation indexes (FST) among Channa argus and Albino Channa argus populations

值為0.22 290～0.40 303，兩組不同烏鱧群體之間的FST值相對高于組內(nèi)群體間的FST值。

將4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分為兩組進行AMOVA分析(表6)，這幾個群體的遺傳變異主要來源于個體內(nèi)，占遺傳變異來源總量的69.65%，有19.95%的遺傳變異來自組間，9.64%來自于組內(nèi)群體間。

表6 烏鱧和白化烏鱧群體的分子方差分析Table 6 AMOVA analysis among the Channa argus and Albino Channa argus populations

通過UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果可以看出4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分別被聚類到了2個獨立分支上(圖1)，4個烏鱧群體中WH和JR群體遺傳距離較近，而3個白化烏鱧群體中LS和NJ群體的遺傳距離相對更近。

圖1 烏鱧和白化烏鱧群體UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 UPGMA phylogenetic tree of Channa argus and Albino Channa argus populations

3 討 論

遺傳多樣性與物種的生存力、適應(yīng)力和進化潛力密切相關(guān)，是評估種群資源狀況的重要依據(jù)，等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)是反應(yīng)群體遺傳多樣性的主要參數(shù)[24]。本研究所有的356個等位基因，Ho介于0.000～0.791，平均值為0.578；He介于0.310～0.910，平均值為0.732，相對與Zhu等[19]對4個不同地區(qū)烏鱧群體的微衛(wèi)星標記的研究中其Ho和He值分別為0.70～0.84和0.69～0.83，通過與前人對烏鱧的研究比較顯示，本研究中的群體Ho和He處于相對較低水平，有研究指出當群體雜合度在0.5～0.8即可認為具有較高的多樣性[24]，本研究的烏鱧群體雜合度均值均高于0.5，總體看來遺傳多樣性較豐富。此外，本研究中的20個微衛(wèi)星標記PIC值介于0.271～0.901，根據(jù)Botstein等[25]的標準PIC≥0.5為高度多態(tài)性，本研究中有16個位點具有高度多態(tài)性(PIC> 0.5)，這些微衛(wèi)星位點為烏鱧和白化烏鱧提供了豐富的遺傳信息，可用于烏鱧和白化烏鱧遺傳多樣性的評估。

通過對4個烏鱧和3個白化烏鱧群體的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)所有在所有群體中WH和HZ群體的Na均大于13個，而DH和JR群體的Na均大于6個，而3個白化烏鱧RC、NJ、LS群體的Na均小于4個，烏鱧群體的Na均高于白化烏鱧，且所有烏鱧群體的Ho和He均高于白化烏鱧群體。通過對兩種烏鱧的PIC值估算發(fā)現(xiàn)白化烏鱧的PIC值為0.344～0.414，處于中度多態(tài)水平，而烏鱧的PIC值為0.513～0.753，處于高度多態(tài)水平，可見白化烏鱧群體的遺傳多樣性要低于烏鱧群體，在繁育過程中應(yīng)加強白化烏鱧遺傳多樣性保護，盡量避免近親交配。

遺傳分化指數(shù)FST是用來衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)，7個群體的FST在0.07 876～0.40 303，且所有群體間的遺傳分化均達顯著水平(P<0.05)，表明群體間均存在一定的遺傳分化。烏鱧群體和白化烏鱧群體間遺傳分化較大，白化烏鱧和烏鱧群體間的FST值為0.22 290～0.40 303，其中白化烏鱧LS群體和烏鱧DH群體間遺傳分化最大(FST=0.40 303)。3個白化烏鱧群體間的FST值為0.08 785～0.12 342，4個烏鱧群體間的FST值為0.07 876～0.17 185，2組烏鱧群體在組內(nèi)群體間遺傳分化相對較小。將4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分為2組進行AMOVA分析可以發(fā)現(xiàn)這幾個群體的遺傳變異主要來源于個體內(nèi)和組間，組內(nèi)群體間變異來源較少。而UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果顯示4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分別被聚類到了2個獨立分支上，表明烏鱧和白化烏鱧間群體間有較明顯的遺傳差異，已有研究推斷白化烏鱧是烏鱧白化變異形成的群體[4, 7, 26]，而根據(jù)本研究結(jié)果可以推斷白化烏鱧經(jīng)過長期的人工定向選育，已經(jīng)開始逐步分化為1個與烏鱧存在較大遺傳差異的獨立群體。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究結(jié)果表明3個白化烏鱧群體的遺傳多樣性均相對低于4個烏鱧，在繁育過程中應(yīng)加強白化烏鱧遺傳多樣性保護，盡量避免近親交配，本研究為烏鱧和白化烏鱧的遺傳資源保護及綜合利用提供理論依據(jù)。