線栓法與改良三氯化鐵法致大鼠大腦中動脈閉塞模型的對比研究

包玉龍，朱竟赫，范英蘭，劉 禾，宋達夫，李顯華，趙 磊

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧沈陽110034）

大腦中動脈是人類缺血性中風的多發(fā)部位、因其側支循環(huán)不豐富，所以普遍認為大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是局灶性腦缺血的標準動物模型［1］。腦栓塞動物模型成功與否關鍵在于腦栓塞部位與范圍，病理生理過程盡可能模擬人的發(fā)病過程。為了適應對腦血栓溶栓治療研究的需要，近年來國內外學者建立了線栓法［2］、三氯化鐵法［3］、自體血栓法［4］等多種栓塞性大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。每種方法均有各自的優(yōu)缺點，例如自體血栓法形成的腦血栓模型，雖較接近臨床［5］，但由于形成的血栓彌散、不固定，所以動物的腦缺血程度和行為表現(xiàn)差異較大［6］。三氯化鐵法形成的腦血栓模型制造方法簡單、可靠、重復性好，且此模型還能反映溶栓藥的藥效，但其不足之處是動物的顴弓被去除，影響動物進食，若長期觀察還需改進［7］。線栓法形成的腦血栓模型雖然拔線后可實現(xiàn)再灌注，但需要一定的手術技巧，同時對插線的直徑、插入的深度要求較為嚴格，在操作中常出現(xiàn)動物腦出血或蛛網膜下腔出血等情況［8］。作者在實踐操作中對三氯化鐵所致大腦中動脈閉塞模型做了進一步的改良，現(xiàn)將該方法與線栓法造模進行對比研究，旨在探索一種更符合人類腦梗死生理病理過程的，便于操作且比較穩(wěn)定的MCAO模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試動物 雄性SD 大鼠，體重250g～300g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXY（遼）2010-0001。

1.1.2 試驗環(huán)境 遼寧省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心。環(huán)境合格證：SYXK（遼）2007-0010。溫度：20℃～23℃。濕度：50%～60%。飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。合格證號：SCXY（京）2009-0012。

1.1.3 試劑 TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑），國藥集團化學試劑有限公司（批號：F20110613）；甲醛，沈陽市新華試劑廠（批號：20110701）；戊巴比妥鈉，SERVA 進口分裝，上海行知化工廠生產，（批號：921019）；磷酸緩沖液，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.4 儀器 CD-200動物顱骨鉆，成都泰盟科技有限公司；微量進樣器，上海高鴿工貿有限公司，規(guī)格10 μL，產品標準號Q／SUUA01-2003 滬 制01130034號；BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；直徑0.185mm 尼龍線由北京上州屋提供；有機硅膠由道康寧由機硅膠有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 改良的三氯化鐵造模方法 取40只健康SD大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉45mg／kg麻醉。參考文獻方法［3，9］在左眼外眥到左外耳道連線的中點處切開皮膚約2cm，沿顴弓下緣依次切斷咬肌和顳肌，分離切除下頜骨冠狀突，暴露鱗狀骨的大部分，用動物顱骨鉆在顴骨和鱗狀骨前聯(lián)合前內2mm 處鉆孔開顱，暴露一段大腦中動脈，使用微量進樣器吸入500g／L三氯化鐵溶液5μL，滴注在大腦中動脈表面，然后逐層縫合肌肉、皮膚。術中及術后麻醉清醒前用烤燈維持動物肛溫37.0℃±0.5℃，動物蘇醒后放回鼠籠。

1.2.2 線栓法造模方法 取40只健康SD 大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg／kg麻醉后，參考文獻方法［2，10-11］將大鼠仰臥固定，剪除頸部毛發(fā)并用碘酊及酒精消毒。取頸正中切口，鈍性分離右側胸鎖乳突肌與胸骨舌肌之間的肌間隙，暴露頸總動脈（common carotid artery，CCA）和迷走神經，用眼科彎鑷挑出頸總動脈（CCA）穿線備用、然后找到頸外動脈（external carotid artery，ECA）、頸內動脈（internal carotid artery，ICA），結扎ECA 及CCA 近端，在CCA 近分叉處剪一小口，將一頭端涂有硅膠且線栓頭端直徑為0.3 mm 的尼龍線線栓經CCA 插入ICA 約18 mm～22 mm 達大腦中動脈（MCA）入口處，此時線栓正好封鎖大腦中動脈開口，阻斷了大腦中動脈的血流。用絲線固定栓子在CCA 內，縫合切口并保持大鼠體溫。

1.2.3 假手術對照組 另取40只大鼠，作為假手術組，手術過程同改良三氯化鐵模型組，但注入5μL生理鹽水。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1 行為指標 為觀察動物行為障礙的程度，各組取10只大鼠在手術造模后不同時間（4、8、24、48 h）對動物行為進行評分，評分標準系參考文獻［12］的方法并加以改良，計分標準如下：

行為1：提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱向地面計為0分，如手術對側前肢出現(xiàn)腕屈曲計為1分，肘屈曲計為2分，肩內旋計為3分，既有腕屈曲和／或肘屈曲，又有肩內旋者，計為4分。

行為2：將動物置于平地面上，分別推雙肩向對側移動，檢查阻力。如雙側阻力對等且有力，計為0分，如向手術對側推動時阻力下降者，根據下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計為1，2和3分。

行為3：將動物雙前肢置于一金屬網上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者及為0分。同樣根據手術對側肌張力下降程度不同計為1，2和3分。

行為4：動物有不停地向一側轉圈者，計為1分。根據標準評分，滿分為11分。分數(shù)越高表示動物行為障礙越嚴重。

1.2.4.2 對大鼠腦缺血面積的影響 各組取10只大鼠在手術造模后24h將大鼠斷頭處死，迅速取出全腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，置于冰鹽水中15min，平均冠狀切4刀成5片2mm 厚腦片，迅速將腦片置于20g／L氯四氮唑（TTC）磷酸緩沖溶液中［13］，37℃避光溫孵染色30min，其間每隔7min～8min翻動一次［14-15］，染色后正常腦組織呈紅色，梗塞缺血組織呈白色，溫孵完畢后用中性甲醛固定（固定時間在24h以內為宜），充分固定后用掃描儀掃描雙側腦片，輸入計算機，利用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)計算腦片梗塞缺血面積，求出每鼠5片腦片總梗塞缺血面積占腦片總面積的百分比。

1.2.4.3 對大鼠腦指數(shù)、腦含水量的影響 各組取10只大鼠在手術造模后24h將大鼠斷頭迅速剝離出全腦稱濕重，計算腦指數(shù)（腦指數(shù)＝腦濕重×100／體重）；再將大鼠全腦置于110℃烘箱烘干，24h后稱干重，計算腦含水量（腦含水量＝（腦濕重-腦干重）／腦濕重×100%）。

1.2.4.4 病理觀察 各組取10只大鼠在手術造模后24h將大鼠斷頭處死，迅速剝離出全腦，將大腦置于40mL／L多聚甲醛溶液中固定后取腦常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后觀察組織形態(tài)學改變。

1.2.4.5 統(tǒng)計分析 應用SPSS統(tǒng)計軟件對各項指標進行統(tǒng)計分析。神經功能缺損評分、組織含水量的比較用方差分析，梗死體積t檢驗。

2 結果

2.1 對大鼠腦血栓后行為狀態(tài)的影響

手術麻醉的大鼠清醒后一般活動狀態(tài)較差，皮毛凌亂無光澤，四肢蜷縮，喜臥，采食飲水量減少、體重下降、腹瀉或稀便等；同時有偏癱樣癥狀出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為不同程度的手術對側前肢內收，肩內旋，肌張力降低，推右肩向對側移動，抵抗阻力降低，甚至有些動物還出現(xiàn)不停地向一側轉圈現(xiàn)象。從表1可以看出，線栓模型組和改良模型組大鼠術后4、8、24h的行為評分維持在高峰階段，48h后行為有所恢復。線栓模型組和改良模型組大鼠術后4、8、24、48h的行為評分均高于假手術組，差異極顯著（P＜0.01）；改良模型組大鼠術后4、8、24、48h的行為評分均高于線栓模型組，差異顯著（P＜0.05）（表1）。

2.2 對大鼠腦指數(shù)、腦含水量、腦缺血面積的影響

線栓模型組和改良模型組大鼠的腦含水量、腦缺血面積均高于假手術組，差異極顯著（P＜0.01）；改良模型組大鼠的腦含水量、腦缺血面積均高于線栓模型組，差異顯著（P＜0.05）（表2）。

2.3 病理檢查

線栓模型組和改良三氯化鐵模型組大鼠病灶側腦表面蒼白、無光，顯微鏡下可見線栓模型組和改良三氯化鐵模型組的大鼠腦片有明顯的神經元壞死，大多數(shù)膠質細胞死亡，梗死邊界清楚，其周圍組織明顯水腫，并發(fā)出血者梗死范圍大且可看到腦表面的出血灶，亦發(fā)現(xiàn)隨手術后時間的延長，缺血軟化灶范圍和 深度有所增加，假手術組檢查腦片均為正常。

表1 對大鼠腦血栓后行為的影響Table 1 Effect on behavior after cerebral thrombosis in rats

表2 手術對大鼠腦指數(shù)、腦含水量、腦缺血面積的影響Table 2 Effects of operation on cerebral index，cerebral water conent and cerebral ischemia area in rats

3 討論

在本試驗中，大鼠在血栓形成后4、8、24h時，行為改變維持在高峰階段，48h后逐漸恢復；但病理檢查發(fā)現(xiàn)隨時間的延長，缺血軟化灶范圍和深度有所增加，出現(xiàn)了行為變化與病理改變不相平行的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象以往也有學者［16］報道，認為可能是由于腦血供側枝循環(huán)豐富，建立了代償功能所致。

線栓法造模的優(yōu)點是不需要開顱，屬于相對非侵入的方法，缺點是需要一定的手術技巧，在操作中常出現(xiàn)動物死亡率高、腦出血或蛛網膜下腔出血、梗死等情況。也有學者報道老齡大鼠因血管脆性大等原因更不適合線栓法造模［17］。由于改良三氯化鐵模型組使用微量進樣器滴注三氯化鐵，所以開顱鉆孔比較小，損傷較少，同時因為不需要像原始造模那樣使濾紙片停滯30min，使操作時間明顯縮短；同時仍保留有大腦中動脈，可進行血管觀察，較接近于臨床，該模型還可以利用TTC 染色技術直觀地觀察腦梗塞程度；并且改良三氯化鐵法制造模型的成功率、穩(wěn)定的梗死范圍、腦水腫程度重、梗死體積等方面都明顯優(yōu)于線栓組，使該模型推廣成為可能?？梢哉f改良三氯化鐵模型為臨床腦缺血性中風發(fā)病機制和防治研究提供了一種簡便有效的手段。

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