• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株甲基對硫磷降解菌-布朗克假絲酵母JMUPMD-1的分離與鑒定*

    2014-06-14 04:36:18張書泰謝順昌杜希萍李利君
    激光生物學(xué)報 2014年2期
    關(guān)鍵詞:有機磷提取液葡萄糖

    張 霞,張書泰,謝順昌,杜希萍,2,3,李利君,2,3*

    (1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心,福建 廈門 361021)

    甲基對硫磷(簡稱PM)又稱甲基1605,是一類目前廣泛使用的高效、高毒的有機磷農(nóng)藥,其主要中間代謝產(chǎn)物為對硝基苯酚(ρ-nitrophenol,PNP),易溶于水,具有中等毒性。在PM降解成PNP過程中,農(nóng)藥的毒性降低了幾十甚至上百倍。但是,由于二者都具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),殘留期很長,給環(huán)境和人類健康帶來潛在的威脅[1-3]。因此,研究有機磷農(nóng)藥的降解具有廣泛的應(yīng)用前景和應(yīng)用價值。

    目前,有機磷的降解途徑主要有光催化降解、化學(xué)降解和微生物降解。光催化降解和化學(xué)降解會造成二次污染且作用效果慢,而微生物能將農(nóng)藥從大分子化合物降解為小分子化合物,最終成為H2O和CO2,實現(xiàn)對環(huán)境的無害化降解[4]。在20世紀(jì)40年代后已經(jīng)成為研究的熱點,已發(fā)現(xiàn)能降解甲基對硫磷的微生物有:鄰單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、木霉屬等[5]。這些分離得到的菌株大部分為細(xì)菌,而在真菌對該農(nóng)藥的降解方面研究相對較少。李樹彬[6]、劉玉煥[7]等研究認(rèn)為真菌對農(nóng)藥的降解具有非常重要的作用。目前廣泛研究的生物反應(yīng)器大多采用細(xì)菌作為微生物主體處理污染物。由于細(xì)菌需要在較濕潤、中性pH的環(huán)境下生長,對于水溶性好的有機物去除率較高,但對于水溶性差和酸性氣體或有酸性物質(zhì)積累的環(huán)境下,就很難達(dá)到處理效果。真菌形態(tài)上多數(shù)是菌絲結(jié)構(gòu),具有較強的穿透力和降解能力,對于干燥環(huán)境和強酸性環(huán)境具有較強的耐受能力。因此真菌在處理有機污染物方面具有很大的應(yīng)用價值。

    本實驗室從有機磷農(nóng)藥污染的土壤里采樣,以PM為磷源配制培養(yǎng)基,分離得到了一株真菌,實驗室編號為JMUPMD-1,本文利用rDNA ITS分子序列分析和表觀形態(tài)及生理生化鑒定方法進(jìn)行鑒定,檢測其降解PM的特點,為以后相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    (1)從受有機磷農(nóng)藥污染的土壤采集樣品,稱取10 g土樣接入100 mL選擇培養(yǎng)基中,在30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d,以10%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮選擇培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d后,再次以10%接種量接種于新鮮選擇培養(yǎng)基中,30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)。

    (2)取第3次富集所得培養(yǎng)液1 mL,將適合濃度的稀釋液0.1 mL涂布于選擇性固體培養(yǎng)基上,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8 d。

    (3)挑取選擇平板上的單菌落進(jìn)行平板劃線分離,純化并保種。

    1.1.2 主要試劑 50%甲基對硫磷乳油購買于福建建甌福農(nóng)化工有限公司,40%樂果乳油購買于山東嘉誠農(nóng)藥化工有限公司,80%敵敵畏乳油購買于福建三農(nóng)集團(tuán)股份有限公司,甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度100 μg/mL,購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所。乙酸乙酯(色譜純),購自美國TEDIA公司,酵母基因組DNA提取試劑盒(離心柱型),購自TIANGEN公司,DNA 凝膠回收試劑盒 DW02-2、dNTPs、Taq酶、10×PCR Buffer均購自廣州東盛生物科技有限公司。ITS1、ITS4 通用引物濃度 25 μmol/L,由上海鼎安生物科技有限公司合成。其它實驗試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 ITS序列的PCR擴增、測定和系統(tǒng)發(fā)育分析 將JMUPMD-1菌株分別在PDA平板和麥芽汁平板上劃線接種,收集對數(shù)生長期菌體,按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書所述步驟提取JMUPMD-1菌株總DNA,并以此為模板用ITS的通用引物 ITS1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'和ITS4:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'對其進(jìn)行擴增[8]。PCR 擴增體系:超純水 16.2 μL、10 × PCR buffer 2.0 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1.0 μL、ITS1(25 μmol/L)0.2 μL、ITS4(25 μmol/L)0.2 μL、DNA模板 0.2 μL、Taq 酶(2.5 U/μL)0.2 μL。PCR 條件:96℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,63℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃后延伸10 min?;厥誔CR產(chǎn)物由英駿生物公司測序,將測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行同源比對。BLAST搜索GenBank數(shù)據(jù)庫中與該序列相似性較高的典型菌株的序列,ClustalX多序列比對,用 MEGA4.1中的 Neighbor-Joining(NJ)和Maximum Parsimony(MP)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Bootstrap對系統(tǒng)樹進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。

    1.2.2 JMUPMD-1菌株的生理生化特性

    (1)葡萄糖發(fā)酵[9]將含有指示劑的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于試管中,裝液量10 mL,每管內(nèi)放一倒置的德漢氏小管,使其充滿培養(yǎng)基,112℃滅菌30 min。接種JMUPMD-1菌株,不接菌為空白對照,不加糖接種為陰性對照,并以釀酒酵母作為陽性對照,28℃靜置培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后開始觀察,觀察1周。如果培養(yǎng)基顏色變黃且有氣泡產(chǎn)生,為發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,為發(fā)酵型;否則為不發(fā)酵葡萄糖型。

    (2)碳源同化實驗[9]預(yù)先配制好YNB液體培養(yǎng)基,以0.5%比例分別加入赤蘚糖醇,半乳糖醇,乳糖,蜜二糖,0.22 μm 濾膜過濾除菌。分別接種JMUPMD-1菌株,以添加葡萄糖不接種作為空白對照,28℃190 rpm搖床培養(yǎng)7 d,試管中培養(yǎng)液變混濁記為陽性,否則記為陰性。結(jié)果觀察標(biāo)準(zhǔn):將已培養(yǎng)數(shù)天的試管振蕩均勻。在一張白色卡片上畫上一條約3/4 mm寬的線,將卡片緊靠試管,對著自然光觀察,如果試管中溶液的混濁度將線掩蓋或變模糊,記此結(jié)果為+;如果溶液非常澄清,則記為-,表示未有酵母生長,即不能利用該碳源。

    (3)尿素水解實驗[10]按培養(yǎng)基配方配制不含尿素的培養(yǎng)基100 mL,121℃滅菌25 min,待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右,將預(yù)先過濾除菌的0.5 g/L的尿素水溶液4 mL添加到培養(yǎng)基中,混勻后分裝到無菌試管中,放置斜面。接種JMUPMD-1菌株,不接菌為空白對照,接種釀酒酵母做陰性對照。28℃培養(yǎng)觀察7 d。如果培養(yǎng)基顏色變紅,說明菌株產(chǎn)生脲酶,分解尿素產(chǎn)氨變堿,記為陽性;否則為陰性。

    (4)50%葡萄糖(w/w)生長實驗[9]配制YPD培養(yǎng)基20 mL,加入0.4 g的瓊脂粉,稱量培養(yǎng)基的重量,加入等重的葡萄糖,加熱溶化后分裝入4根試管中,112℃滅菌30 min,放置斜面。接種JMUPMD-1菌株,不接菌為空白對照,28℃恒溫培養(yǎng)10 d。若能生長則說明該菌能耐受高濃度的葡萄糖,不生長則不能。

    (5)硝酸鹽生長實驗[9]配制 YCB培養(yǎng)基100 mL,其中40 mL添加1%KNO3,30 mL加 1%硫酸銨作為陽性對照,剩余30 mL不加任何氮源作為陰性對照,0.22 μm濾膜過濾除菌,分裝于無菌大試管中,每管約10 mL,接種菌株JMUPMD-1,并做空白對照。28℃搖床培養(yǎng)7 d,根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁度分析判斷。

    1.2.3 形態(tài)鑒定 菌株JMUPMD-1接種于MEA平板上,于28℃恒溫培養(yǎng)。7 d后對菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進(jìn)行觀察。

    1.2.4 甲基對硫磷的檢測 氣相色譜檢測條件:VARIAN CP-3800氣相色譜儀;色譜柱:HP-50毛細(xì)管柱,30 m × 530 μm × 1 μm;色譜柱 溫度:100 ℃(3 min)240℃(15 min);TSD檢測器溫度:300℃;進(jìn)樣口溫度:240℃;載氣:99.999%高純氮氣,流速30 mL/min;氫氣5 mL/min;空氣175 mL/min;進(jìn)樣量 1 μL,分流比 30∶1。

    分析測定方法:稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,取2 mL培養(yǎng)液,添加1 g NaCl充分渦旋、鹽析;加入等體積乙酸乙酯提取,充分振蕩,靜置30 min,分離乙酸乙酯相;無水Na2SO4脫水,N2吹干;加1 mL乙酸乙酯搖勻,氣相色譜檢測(圖1)。

    圖1 JMUPMD-1菌株對甲基對硫磷降解的氣相色譜圖Fig.1 Degradation to parathion-methyl in the presence of JMUPMD-1 determined by Gas Chromatography(GC)

    1.2.5 JMUPMD-1菌株對環(huán)境中甲基對硫磷降解的模擬試驗 將JMUPMD-1菌株分別接種于選擇性液體培養(yǎng)基中,添加0.1%甲基對硫磷乳油為唯一磷源(培養(yǎng)液初始濃度約為350 μg/L),以不接菌為對照組,在30℃下190 r/min培養(yǎng)7 d后,測定甲基對硫磷的濃度,計算JMUPMD-1菌株對甲基對硫磷的降解率。

    1.2.6 JMUPMD-1菌株甲基對硫磷降解酶液的制備及活性測定 分別制備三株菌的發(fā)酵上清液及胞內(nèi)提取液,加入適量的甲基對硫磷進(jìn)行反應(yīng),測定反應(yīng)后甲基對硫濃度變化。

    胞外提取液:菌株液體培養(yǎng)至6 d時,取50 mL發(fā)酵液8000 r/min離心,上清即為胞外提取液。

    胞內(nèi)提取液:收集上步離心后的菌體,用蒸餾水洗滌菌體3次,將菌體置入研磨內(nèi),加入適量的石英砂,放入冰箱中預(yù)冷,然后充分研磨。反復(fù)預(yù)冷研磨3次后加入10 mL 50 mmol/L的pH6.8磷酸鹽緩沖液,全部轉(zhuǎn)移至離心管中,0-4℃條件下浸泡24 h,8000 r/min離心得上清,即為胞內(nèi)提取液。

    反應(yīng)體系:30 μL濃度約為800 mg/L甲基對硫磷乳液,1950 μL 提取液(對照組為1950 μL 磷酸鹽緩沖液),35 ℃下反應(yīng) 40 min,20 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。依據(jù)1.2.3的分析測定方法測定各反應(yīng)體系中甲基對硫磷的濃度,并計算對照組和提取液處理組40 min后甲基對硫磷的濃度減少量。運用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,確定各組中甲基對硫磷降解的顯著性。

    2 結(jié)果

    2.1 JMUPMD-1菌株rDNA ITS區(qū)域的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

    提取JMUPMD-1的DNA為模板,用酵母ITS區(qū)域通用引物ITS1和ITS4為引物,進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)并對相應(yīng)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,共447個堿基,將序列提交到GenBank獲得登記注冊號為HM564395。利用BLAST軟件將所得基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示菌株JMUPMD-1與Candida blankii的同源性最高,達(dá)99%。收集與JMUPMD-1同源性較高的菌株序列,采用ClustslX進(jìn)行多序列匹配比對,通過MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),結(jié)果表明 JMUPMD-1菌株同 Candida blankii WM 0719(FM178304)和Candida blankii MUCL29808(EU343873)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切,位于同一個分支。

    圖2 菌株JMUPMD-1 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree derived from ITS sequences of strain JMUPMD-1

    2.2 JMUPMD-1的生理生化特性

    對JMUPMD-1菌株進(jìn)行系列生理生化實驗,JMUPMD-1發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;赤蘚糖醇、半乳糖醇、乳糖和蜜二糖的同化實驗表明JMUPMD-1可以同化赤蘚糖醇、半乳糖醇和乳糖,不能同化蜜二糖;尿素水解實驗顯示該菌株不能產(chǎn)生尿酶,所以不能分解尿素使指示劑變色;JMUPMD-1菌株在50%的高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中不能生長,呈陰性,說明高濃度葡萄糖對該菌株的生長有很強抑制作用;JMUPMD-1在YPD培養(yǎng)基上于37℃條件下生長良好;氮源同化實驗中,以硫酸銨為唯一氮源的培養(yǎng)液變渾濁,以硝酸鉀為唯一氮源的培養(yǎng)液未見渾濁,表明JMUPMD-1不能同化硝酸鉀作為生長氮源。JMUPMD-1生理生化實驗結(jié)果匯總后同《酵母菌的特征與鑒定手冊》中Candida blankii標(biāo)準(zhǔn)菌株比較(表2.4),結(jié)果顯示JMUPMD-1的生理生化特性同Candida blankii標(biāo)準(zhǔn)菌株的特性基本相符,只有葡萄糖發(fā)酵實驗中,JMUPMD-1可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,而Candida blankii標(biāo)準(zhǔn)菌株對葡萄糖發(fā)酵是可變的、不確定的(V),因此我們也認(rèn)為是相符的。

    表1 JMUPMD-1生理生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of JMUPMD-1

    2.3 JMUPMD-1 的形態(tài)觀察

    菌株JMUPMD-1在MEA平板28℃培養(yǎng)7 d后,菌落呈白色,表面光滑,中心隆起,致密不透明,邊緣整齊、羽毛狀,推測是假菌絲的的宏觀表現(xiàn)。正反面顏色一致,菌落直徑 為 0.6 cm(圖 3A)。取JMUPMD-1培養(yǎng)液進(jìn)行制片觀察,該菌單細(xì)胞為圓形,直徑 2.4-2.8 μm,有頂端出芽和三端出芽的繁殖方式(圖3B);取菌落邊緣制片觀察,發(fā)現(xiàn)該菌株具有假菌絲,寬約 2.75 μm,假菌絲上產(chǎn)生厚垣孢子(圖3C)。

    圖3 JMUPMD-1的培養(yǎng)性狀及顯微特征Fig.3 Cultural and microscopic characteristics of strain JMUPMD-1

    2.4 JMUPMD-1菌株降解甲基對硫磷能力和菌株提取液酶活測定

    對JMUPMD-1菌株降解甲基對硫磷能力測定,甲基對硫磷由初始濃度350 μg/L降低至102.5 μg/L,降解率為 48.6% 。

    對JMUPMD-1菌株的胞內(nèi)提取物和胞外提取物對甲基對硫磷的降解酶活性測定,經(jīng)胞內(nèi)提取物處理40 min后,甲基對硫磷含量減少了3.3 mg/L,經(jīng)胞外提取液處理40 min的甲基對硫磷含量僅減少0.36 mg/L。因此可以確定JMUPMD-1菌株發(fā)酵液上清無甲基對硫磷降解酶活性,胞內(nèi)提取液具有甲基對硫磷降解酶活性。

    3 討論

    甲基對硫磷作為有機磷殺蟲劑,具觸殺和胃毒作用,能抑制害蟲神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿酯酶的活力而使其致死,殺蟲譜廣,能防治水稻、棉花、果樹、茶葉、蔬菜等作物的多種害蟲,但其防治效果較低,使用時用量較大,因此治理甲基對硫磷的污染對于保證環(huán)境安全和人類健康都有重要的意義[11-15]。目前,對于甲基對硫磷的降解機理的研究已較為透徹,也有不少的相關(guān)報道。在相關(guān)的報道中,關(guān)于細(xì)菌對甲基對硫磷的降解研究報道較多,真菌對甲基對硫磷的降解研究報道較少。本實驗室從集美大學(xué)附近土壤里分離到一株能以PM為磷源的真菌JMUPMD-1,經(jīng)鑒定該菌為布朗克假絲酵母菌,該菌不僅能在以甲基對硫磷為磷源的培養(yǎng)基中降解甲基對硫磷,即使在含有容易利用的磷源條件下(如K2HPO4)也可以降解甲基對硫磷。在該菌株培養(yǎng)基上清液未檢測出甲基對硫磷降解酶的活性,其所表達(dá)的甲基對硫磷降解酶為胞內(nèi)酶。本實驗發(fā)現(xiàn),以350 μg/L甲基對硫磷為唯一磷源和350 μg/L甲基對硫磷及1 g/L K2HPO4組成的混合磷源培養(yǎng)該菌株,該菌降解率達(dá)48.6%,既豐富了甲基對硫磷降解菌廣譜,同時也為構(gòu)建工程菌提高降解酶的表達(dá)量,從而提高對農(nóng)藥的降解力和生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶制劑奠定基礎(chǔ)。

    [1]解秀平,閆艷春,劉萍萍.甲基對硫磷徹底降解菌X4的分離、降解性及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].微生物學(xué)報,2006,46(6):979-983.XIE Xiuping,YAN Yanchun,LIU Pingping.Isolation,degradation and phylogenetic analysis of methylparathion degradative strain X4[J].Acta Microbiologica Sinica,2006,46(6):979-983.

    [2]李海雷,孫宏春,張奇志,等.節(jié)桿菌屬甲基對硫磷的降解菌株L-W的分離及降解特性[J].核農(nóng)學(xué)報,2008,22(2):192-195.LI Hailei,SUN Hongchun,ZHANG Qizhi,et al.Isolation of methylparathion degrading strain L-W and ITS degradability[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2008,22(2):192-195.

    [3]劉智,洪青,張曉舟,等.甲基對硫磷降解菌 DLL-E4降解對-硝基苯酚特性[J].中國環(huán)境科學(xué),2003,23(4):435-439.LIU Zhi,HONG Qing,ZHANG Xiaozhou,et al.Character of ρnitrophenol degradation by methyl Parathion degrading strain DLL-E4[J].China Environmental Science,2003,23(4):435-439.

    [4]崔中利,李順鵬,何健.甲基一六O五降解菌J5的分離及其降解性狀研究[J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境,2001,(3):21-25.CUI Zhongli,LI Shunpeng,HE Jian.Study on the isolation of methyl parathion degrading Bacillus strain J5 and the characteristics of the degradation[J].Rural Eco-Environment,2001,(3):21-25.

    [5]許育新,馮昭中,陸鵬,等.甲基對硫磷降解菌PF32的分離鑒定及其降解特性研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,2009,11(3):329-334.XU Yuxin,F(xiàn)ENG Zhaozhong,LU Peng,et al.Isolation and characterization of capable of degrading parathion-Methyl bacterium Stenotrophomonas sp.PF32[J].Chinese Journal of Pesticide Science,2009,11(3):329-334.

    [6]李樹彬,周仁超,劉玉煥,等.曲霉M-2降解有機磷農(nóng)藥(甲胺磷)的研究[J].微生物學(xué)通報,1996,26(1):27-30.LI Shubin,ZHOU Renchao,LIU Yuhuan,et al.The studies on methamidophos-degrading Aspergillus M-2[J].Journal of Microbiology,1996,26(1):27-30.

    [7]劉玉煥,鐘英長.真菌降解有機磷農(nóng)藥樂果的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2000,20(1):95-99.LIU Yuhuan,ZHONG Yingchang.Degradation of organophosphate insecticide(Dimethoate)by Aspergillus sp.Z58[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2000,20(1):95-99.

    [8]焦紅茹,劉樹文,祖顯生,等.赤霞珠相關(guān)酵母菌的分離及其分子生物學(xué)鑒定[J].釀酒科技,2008,(12):17-20.JIAO Hongru,LIU Shuwen,ZU Xiansheng,et al.Isolation and molecular biology identification of yeasts related to cabernet sauvignon[J].Liquor-Making Science&Technoloy,2008,(12):17-20.

    [9]BARNETT J,PAYNE R,YARROW D.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].青島:青島海洋大學(xué)出版社,1991.BARNETT J,PAYNE R,YARROW D.Characteristics and identification of yeasts[M].Qingdao:Qingdao Ocean University Press,1991.

    [10]沈萍,陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京:高等教育出版社,2007.SHEN Ping,CHEN Xiangdong.Experiment of Microbiology[M].Beijing:Advanced Education Press,2007.

    [11]WANG S,ZHANG C,YAN Y.Biodegradation of methyl parathion and p-nitrophenol by a newly isolated Agrobacterium sp.strain Yw12[J].Biodegradation,2012,23(1):107-116.

    [12]SHEN Y-J,LU P,MEI H,et al.Isolation of a methyl parathion-degrading strain Stenotrophomonas sp.SMSP-1 and cloning of the ophc2 gene[J].Biodegradation,2010,21(5):785-792.

    [13]劉萍萍,閆艷春,解秀平.降解甲基對硫磷菌株 YL8的分離,純化及降解機理[J].中國環(huán)境科學(xué),2006,26(2):206-209.LIU Pingping,YAN Yanchun,XIE Xiuping.The Mechanism of purification and degradation of methylparathion-degrading bacterium YL8[J].China Environmental Science,2006,26(2):206-209.

    [14]張瑞福,戴青華,何健,等.七株有機磷農(nóng)藥降解菌的降解特性比較[J].中國環(huán)境科學(xué),2004,24(5):584-587.ZHANG Ruifu,DAI Qinghua,HE Jian,et al.Comparison of degrading characteristics of seven organophosphate pesticide-degrading bacteria[J].China Environmental Science,2004,24(5):584-587.

    [15]楊柳,陳少華,趙川,等.新技術(shù)在農(nóng)藥微生物降解中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報,2010,3:76-80.YANG Liu,CHEN Shaohua,ZHAO Chuan,et al.Application of new technology in pesticide microbial degradation[J].Biotechnology Bulletin,2010,3:76-80.

    猜你喜歡
    有機磷提取液葡萄糖
    葡萄糖漫反射三級近紅外光譜研究
    亞麻木脂素提取液滲透模型建立與驗證
    糖耐量試驗對葡萄糖用量的要求
    穿山龍?zhí)崛∫翰煌兓椒ǖ谋容^
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:06
    有機磷化工廢水治理方法探討
    山香圓葉提取液純化工藝的優(yōu)化
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:28
    葡萄糖對Lactobacillus casei KDL22發(fā)酵及貯藏性能的影響
    有機磷改性納米SiO2及其在PP中的應(yīng)用
    中國塑料(2016年2期)2016-06-15 20:29:59
    有機磷中毒致周圍神經(jīng)損害的電生理研究
    多發(fā)性肺硬化性血管瘤18~F-脫氧葡萄糖PET/CT顯像1例
    纵有疾风起免费观看全集完整版| 激情视频va一区二区三区| av女优亚洲男人天堂| 免费在线观看黄色视频的| 99re6热这里在线精品视频| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产av一区二区精品久久| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 欧美精品一区二区免费开放| 男人操女人黄网站| 五月伊人婷婷丁香| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成人国产麻豆网| 亚洲国产av新网站| 国产男人的电影天堂91| 国产片内射在线| 亚洲精品日本国产第一区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 90打野战视频偷拍视频| 观看av在线不卡| 黄片播放在线免费| 美女视频免费永久观看网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 在线观看www视频免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产极品天堂在线| 亚洲情色 制服丝袜| 一二三四在线观看免费中文在 | 日本vs欧美在线观看视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美成人午夜免费资源| 免费高清在线观看日韩| 最新中文字幕久久久久| 好男人视频免费观看在线| 国产爽快片一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 视频在线观看一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 如何舔出高潮| 亚洲成色77777| 欧美bdsm另类| 咕卡用的链子| 97在线人人人人妻| 日本-黄色视频高清免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品久久久精品久久久| 成人综合一区亚洲| 大话2 男鬼变身卡| 日韩三级伦理在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 91成人精品电影| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 综合色丁香网| 九九爱精品视频在线观看| 五月开心婷婷网| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲,一卡二卡三卡| 飞空精品影院首页| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久久伊人网av| videossex国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美xxⅹ黑人| 欧美另类一区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲av.av天堂| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品一区www在线观看| h视频一区二区三区| 国产永久视频网站| 伦理电影免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲美女视频黄频| 亚洲四区av| 美女中出高潮动态图| 欧美精品一区二区大全| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| av免费观看日本| 黄色毛片三级朝国网站| 日本欧美视频一区| 视频在线观看一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 久热久热在线精品观看| 国产探花极品一区二区| 美女主播在线视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 尾随美女入室| 日本wwww免费看| av国产久精品久网站免费入址| 在线观看人妻少妇| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久热久热在线精品观看| 国产精品久久久av美女十八| 十八禁网站网址无遮挡| 1024视频免费在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 飞空精品影院首页| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲综合色网址| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品日本国产第一区| 国产av一区二区精品久久| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品久久午夜乱码| 新久久久久国产一级毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 午夜久久久在线观看| 日韩一区二区三区影片| 在线精品无人区一区二区三| 桃花免费在线播放| 下体分泌物呈黄色| 国产在线视频一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲国产精品999| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久午夜福利片| 天天影视国产精品| 欧美日韩视频精品一区| 春色校园在线视频观看| 亚洲,欧美精品.| 69精品国产乱码久久久| 老司机影院成人| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一区二区av电影网| 国产精品一区www在线观看| 久久av网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲国产最新在线播放| 久久久欧美国产精品| 国产一区二区三区av在线| 国产免费视频播放在线视频| 人妻 亚洲 视频| 街头女战士在线观看网站| 国产成人免费无遮挡视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av网站免费在线观看视频| 国产精品一区二区在线不卡| videos熟女内射| 男的添女的下面高潮视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 超色免费av| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品一区二区免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 熟女电影av网| 激情五月婷婷亚洲| 国产日韩欧美亚洲二区| 大香蕉久久成人网| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美国产精品一级二级三级| 国产男女内射视频| av国产久精品久网站免费入址| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产乱人偷精品视频| 99国产精品免费福利视频| 欧美精品一区二区大全| 久久久久精品久久久久真实原创| 两个人看的免费小视频| 下体分泌物呈黄色| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 看十八女毛片水多多多| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av福利一区| 丰满少妇做爰视频| 黄色 视频免费看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久精品国产国产毛片| 涩涩av久久男人的天堂| 久久人妻熟女aⅴ| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产成人精品一,二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美人与性动交α欧美软件 | 黄色毛片三级朝国网站| 蜜桃在线观看..| 精品久久久久久电影网| 人妻少妇偷人精品九色| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕最新亚洲高清| 在线观看一区二区三区激情| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久久精品人妻al黑| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 香蕉精品网在线| 欧美xxⅹ黑人| 好男人视频免费观看在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产成人91sexporn| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久综合国产亚洲精品| 91成人精品电影| 日本与韩国留学比较| 春色校园在线视频观看| 国产欧美亚洲国产| 精品第一国产精品| 免费人成在线观看视频色| 99热国产这里只有精品6| 在线 av 中文字幕| 欧美最新免费一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品亚洲成a人片在线观看| 一区二区三区精品91| 一本大道久久a久久精品| 欧美+日韩+精品| 亚洲av福利一区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久97久久精品| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 另类精品久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线观看免费高清a一片| 赤兔流量卡办理| 精品久久久久久电影网| 一级爰片在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产色片| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品人妻在线不人妻| 亚洲国产精品专区欧美| 中文字幕免费在线视频6| 22中文网久久字幕| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成年动漫av网址| 精品久久久久久电影网| 中文字幕亚洲精品专区| 22中文网久久字幕| 亚洲精品日本国产第一区| videosex国产| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品熟女少妇av免费看| 9191精品国产免费久久| 两个人免费观看高清视频| 极品人妻少妇av视频| 青春草国产在线视频| 精品熟女少妇av免费看| 性色avwww在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 国产一区二区在线观看日韩| 少妇人妻精品综合一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 嫩草影院入口| 成年人免费黄色播放视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 婷婷色综合大香蕉| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av日韩在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 中文字幕制服av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产在视频线精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费大片18禁| 尾随美女入室| 国产视频首页在线观看| 赤兔流量卡办理| 精品午夜福利在线看| 久久精品国产亚洲av天美| av播播在线观看一区| 久久久久精品性色| 亚洲av日韩在线播放| 99九九在线精品视频| 十八禁网站网址无遮挡| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久精品免费免费高清| 少妇的丰满在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 日本与韩国留学比较| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 最后的刺客免费高清国语| 国产一区二区激情短视频 | 超碰97精品在线观看| a级毛片在线看网站| 免费日韩欧美在线观看| 在线看a的网站| 久久午夜福利片| 黄色一级大片看看| 久久97久久精品| 亚洲国产精品999| 黑人猛操日本美女一级片| 伊人久久国产一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲人与动物交配视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久韩国三级中文字幕| av有码第一页| 在线观看免费高清a一片| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久国产精品大桥未久av| 久久99热这里只频精品6学生| 久久av网站| 成人影院久久| 亚洲国产精品999| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品人妻在线不人妻| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜福利乱码中文字幕| 在线观看三级黄色| 亚洲丝袜综合中文字幕| 男女高潮啪啪啪动态图| 蜜桃在线观看..| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲精品一二三| 国产男女内射视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久久久久久久成人| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久av网站| 成人漫画全彩无遮挡| 久久狼人影院| 欧美另类一区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品不卡视频一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 成年人免费黄色播放视频| 看免费av毛片| 女人久久www免费人成看片| 高清不卡的av网站| 免费av不卡在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 女人久久www免费人成看片| 黄色毛片三级朝国网站| 免费av不卡在线播放| 美女内射精品一级片tv| 色网站视频免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 婷婷色综合www| 久久人妻熟女aⅴ| 国内精品宾馆在线| 一级片免费观看大全| av不卡在线播放| 免费观看av网站的网址| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久精品夜色国产| 国产精品无大码| 啦啦啦啦在线视频资源| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久人妻| 日韩精品有码人妻一区| 国产乱人偷精品视频| 七月丁香在线播放| 一级爰片在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲性久久影院| 人人澡人人妻人| 久久久久精品人妻al黑| 美女内射精品一级片tv| 九九在线视频观看精品| 亚洲国产色片| 一区二区三区精品91| 亚洲av综合色区一区| 婷婷色综合大香蕉| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲,欧美精品.| 天堂8中文在线网| 成年人免费黄色播放视频| 国产成人a∨麻豆精品| 色网站视频免费| 国产亚洲精品久久久com| 永久免费av网站大全| 国产精品99久久99久久久不卡 | 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲精品日本国产第一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 2018国产大陆天天弄谢| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久久久久精品精品| 色网站视频免费| 热99国产精品久久久久久7| 欧美精品一区二区大全| 久久精品久久久久久久性| 五月伊人婷婷丁香| 男女午夜视频在线观看 | 欧美激情国产日韩精品一区| 99久久精品国产国产毛片| 大话2 男鬼变身卡| 欧美成人午夜精品| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产精品国产精品| 高清av免费在线| 国产不卡av网站在线观看| 国产综合精华液| 看免费成人av毛片| 午夜老司机福利剧场| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩亚洲高清精品| 色吧在线观看| 另类亚洲欧美激情| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲av电影在线进入| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人黄色视频免费在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 尾随美女入室| 嫩草影院入口| 交换朋友夫妻互换小说| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品,欧美精品| 18禁观看日本| 各种免费的搞黄视频| 成年动漫av网址| 成人漫画全彩无遮挡| 伦理电影大哥的女人| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产一级毛片在线| av片东京热男人的天堂| 精品人妻在线不人妻| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜福利视频在线观看免费| 国产视频首页在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 99热国产这里只有精品6| 久久久a久久爽久久v久久| 国国产精品蜜臀av免费| www.av在线官网国产| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩人妻精品一区2区三区| 蜜桃国产av成人99| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久这里有精品视频免费| 日本av手机在线免费观看| 免费大片黄手机在线观看| 午夜老司机福利剧场| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久久久伊人网av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产片特级美女逼逼视频| 国产黄频视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 伦理电影免费视频| 亚洲成色77777| 久久久久精品性色| 日韩中字成人| 青春草视频在线免费观看| 天堂8中文在线网| 色网站视频免费| 一二三四在线观看免费中文在 | 韩国高清视频一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 宅男免费午夜| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 中文字幕制服av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产午夜精品一二区理论片| 国产1区2区3区精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品456在线播放app| 桃花免费在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产综合久久久 | 成年av动漫网址| 大码成人一级视频| 亚洲,欧美,日韩| 最近手机中文字幕大全| 国产精品国产三级专区第一集| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美国产精品一级二级三级| 久久久久久久久久久免费av| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美人与善性xxx| 99久久精品国产国产毛片| 两性夫妻黄色片 | 亚洲美女视频黄频| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av国产av综合av卡| av线在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级| 人体艺术视频欧美日本| 麻豆乱淫一区二区| 色吧在线观看| 99国产精品免费福利视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜av观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 黄片播放在线免费| 国产成人精品久久久久久| 国产精品久久久久久精品古装| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 五月天丁香电影| 欧美bdsm另类| 少妇的逼水好多| av国产久精品久网站免费入址| 这个男人来自地球电影免费观看 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产男女内射视频| 色94色欧美一区二区| 99热6这里只有精品| 女人精品久久久久毛片| 人妻一区二区av| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩中字成人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产xxxxx性猛交| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品视频女| 丁香六月天网| 日本av手机在线免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 成人二区视频| 有码 亚洲区| 久久国产精品大桥未久av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品久久蜜臀av无| av有码第一页| 一边摸一边做爽爽视频免费| 十分钟在线观看高清视频www| 91精品三级在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲国产av影院在线观看| 蜜桃在线观看..| av不卡在线播放| 免费在线观看黄色视频的| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美人与性动交α欧美软件 | 国产又爽黄色视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 丝袜人妻中文字幕| 少妇精品久久久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 22中文网久久字幕| 精品亚洲成国产av| av在线播放精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 乱人伦中国视频| 黄片播放在线免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| av在线app专区| 久久精品久久精品一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 天天影视国产精品| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品成人在线| 欧美97在线视频| 毛片一级片免费看久久久久| av播播在线观看一区| 97在线人人人人妻| 久久久精品94久久精品| 在线天堂中文资源库| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站|