固相萃取-高效液相色譜法測定復(fù)合薯片中丙烯酰胺＊

蔡 文，譚興和1，* ，張 喻1，，王 鋒1，，張春艷1，，鄧潔紅1，

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128;2.柑桔資源綜合利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

油炸薯片是深受大眾喜愛的休閑食品之一，但是該淀粉類食品在高溫加工條件下容易產(chǎn)生丙烯酰胺，薯片因含水率低使其產(chǎn)生的丙烯酰胺遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它高溫油炸產(chǎn)品［1，2］。丙烯酰胺是世界公認(rèn)的有毒有害物質(zhì)，具有致癌性、神經(jīng)毒性、基因毒性、遺傳毒性［3-6］。過量攝入含有丙烯酰胺的食品，可能會對人們的健康造成威脅［7］。因此，減少或抑制食品中丙烯酰胺的生成是食品安全領(lǐng)域的重要課題。目前丙烯酰胺的檢測分析方法應(yīng)用較多的主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［8，9］。利用 GC-MS 檢測丙烯酰胺，需要對分析物進(jìn)行衍生化處理，操作復(fù)雜，相對費(fèi)時。LC-MS/MS法雖然無需衍生化處理，但是科研投入較大，不利于在實(shí)驗(yàn)室普及。薯片中的丙烯酰胺含量容易超標(biāo)，具有研究代表性。目前關(guān)于高效液相色譜法測定丙烯酰胺含量的研究中，專門針對油炸復(fù)合薯片進(jìn)行系統(tǒng)研究的不多。復(fù)合薯片基質(zhì)復(fù)雜，提取液去油脂、蛋白質(zhì)等前處理后進(jìn)樣分析，色譜圖中丙烯酰胺峰受雜峰影響大，導(dǎo)致目標(biāo)峰峰形不好或難以與雜峰分離，需要進(jìn)一步凈化處理。因此，本研究旨在通過固相萃取小柱與高效液相色譜聯(lián)用，采用二極管陣列檢測器測定復(fù)合薯片中的丙烯酰胺含量，建立一種經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定可靠、成本較低的丙烯酰胺高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2995光電二極管陣列檢測器、Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent TC-C18高效 Reliance保護(hù)柱(4.6 mm × 12.5 mm，5 μm)、Agilent TC-C18柱芯、密理博明澈-D24UV超純水機(jī)、賽多利斯BS224S型電子天平、Eppendorf 5804 R臺式冷凍離心機(jī)、SKY-200B型蘇坤氣浴搖床、友田YZ-1531-B 1.5L控溫油炸鍋、壓片機(jī)、Eppendorf移液槍(0-100 μL、100-1000 μL、1000-5000 μL)、Waters Oasis HLB 固相萃取小柱(200 mg/6cc)、希波氏 0.45 μm 尼龍針筒過濾器。

1.2 材料與試劑

大西洋馬鈴薯:采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。

棕櫚油:產(chǎn)自中儲糧油脂工業(yè)東莞有限公司，購自湖南長沙市高橋大市場。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級，濃度為1000 mg/L，體積為1 mL，購自 AccuStandard公司)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜級)、正己烷(分析純)、亞鐵氰化鉀(分析純)、硫酸鋅(分析純)、試驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 油炸復(fù)合薯片的制作工藝及操作要點(diǎn)［10］

新鮮馬鈴薯→清洗→機(jī)械去皮→蒸熟(100℃，15 min)→切片(厚度約3.0 mm)→隧道干燥箱干燥(60℃，10 h)→粉碎→過篩(80目)→配料→加水(40%，以馬鈴薯顆粒全粉質(zhì)量計(jì))→和粉→壓片(厚度為1 mm)→切片(直徑為5.0 cm)→油炸至金黃色(170℃，50 s)→出鍋→瀝油→研磨待測。

1.3.2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將濃度為1000 mg/L丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置于棕色瓶中，貯藏在冰箱中冷藏備用。用該貯備液配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 五個不同濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 樣品前處理［11，12］準(zhǔn)確稱取 5.0000 g 粉碎均勻的復(fù)合薯片樣品于50 mL的錐形瓶中，加入一定體積的提取溶劑和蛋白質(zhì)沉淀劑，漩渦震蕩20 min后在低溫冷凍離心機(jī)上以10000 r/min離心20 min，過濾除去油層取濾液約5 mL至分液漏斗中，用正己烷以1∶1萃取兩次。將水相液過0.45 μm微孔濾膜，再取2 mL濾液過經(jīng)預(yù)先處理的固相萃取小柱(預(yù)處理是先用3 mL甲醇通過小柱，然后讓3 mL超純水通過小柱)，待樣液全部通過小柱后用洗脫液洗脫，棄去最初0.5 mL流出液后收集濾液用于液相分析。

式中，X為樣品中丙烯酰胺的含量(mg/kg);C為對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中丙烯酰胺的含量(mg/L);V為樣品提取液的總體積(mL);M為樣品的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙烯酰胺測定條件的確定

將丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在190-210 nm波長范圍進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)在190-200 nm之間目標(biāo)峰的峰面積隨波長的增加逐漸增大，然后逐漸減小。綜合考慮流動相各成分的截止吸收波長，確定檢測波長為210 nm。分別以不同的流動相比例、流速、柱溫、進(jìn)樣量分析丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，綜合各色譜曲線中目標(biāo)峰的峰形、保留時間等因素，最終選定流動相為甲醇/水(5∶95;V/V)、流速為 0.6 mL/min、柱溫為30℃、進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下，色譜峰峰形良好，保留時間合理。丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰圖如圖1所示。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of acrylamide standards

2.2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及檢測限

在最佳色譜檢測條件下將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)的丙烯酰胺濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程:Y=9.90 × 104X-1.57 ×103，相關(guān)系數(shù)為 0.9993，在0.2～1.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再將丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至一定程度進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示濃度為0.01 mg/L時儀器能較好地檢出，由此可知該儀器及檢測方法的最低檢測限小于10 ng/mL，該檢測限范圍及線性關(guān)系能夠滿足本試驗(yàn)的分析要求。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

試驗(yàn)中比較了不經(jīng)固相萃取小柱處理和經(jīng)過處理的樣品液進(jìn)樣分析后的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)固相萃取小柱凈化處理的色譜圖中雜峰較少，峰的分離度大大提高。參考相關(guān)文獻(xiàn)［13，14］，選取 Oasis HLB固相萃取小柱對樣品液進(jìn)行凈化處理。

圖2 丙烯酰胺在HLB柱上的水洗脫曲線Fig.2 Elution curve of acrylamide by water on HLB cartridge

試驗(yàn)中采用不同比例的甲醇/水溶液作為洗脫劑，色譜數(shù)據(jù)顯示純水洗脫時，洗脫液中的雜質(zhì)更少，丙烯酰胺回收率更高。圖2是1.0 mg/L的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在HLB柱上的洗脫曲線。由圖可見，上樣流出液中完全檢測不出丙烯酰胺，說明丙烯酰胺在HLB柱上有較好地保留。丙烯酰胺完全被洗脫需要約3 mL水。誤差分析顯示HLB柱用于樣品凈化處理穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，平均回收率達(dá)99.43%。樣品的洗脫曲線顯示，極性雜質(zhì)主要集中在最初的0.5 mL洗脫液中。因此，實(shí)際操作中，棄去最初0.5 mL流出液后收集濾液用于液相分析。樣品液色譜峰圖如圖3所示，可見目標(biāo)峰峰形良好，丙烯酰胺峰與其它雜峰能夠很好地分離。

2.4 精密度試驗(yàn)

將一定濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，連續(xù)測定6次。結(jié)果見表1。6次進(jìn)樣峰面積平均值為96402微伏*秒，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.19%，說明該儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將樣品液置于室溫，分別在 0、1、2、3、4、5、6h 時進(jìn)樣檢測，丙烯酰胺色譜峰的峰面積結(jié)果見表2。7次進(jìn)樣峰面積平均值為13743微伏*秒，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.32%，說明該復(fù)合薯片樣品溶液在6 h內(nèi)比較穩(wěn)定，利于實(shí)驗(yàn)室中的批量處理。

表1 精密度試驗(yàn)測定結(jié)果Tab.1 Results of precision experiment

圖3 樣品液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sample

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果Tab.2 Results of stability experiment

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取6份樣品，按1.2.3進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣檢測，測定各丙烯酰胺的含量，結(jié)果見表3。5次進(jìn)樣丙烯酰胺含量平均值為0.9171 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.69%，說明該方法重現(xiàn)性良好。

表3 重現(xiàn)性結(jié)果Tab.3 Results of reproducibility experiment

2.7 回收率試驗(yàn)

取自制油炸復(fù)合薯片樣品，加入三個不同濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個樣品平行測定三次，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。由表可見加標(biāo)回收率在80%以上。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.4 Results of spiked recovery experiment(n=3)

3 結(jié)論

本文采用固相萃取-高效液相色譜法測定油炸復(fù)合薯片中的丙烯酰胺，樣品在0.1%的甲酸水溶液中提取，采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱對提取液凈化處理，能較好地去除雜質(zhì)的干擾。樣品液在流動相為甲醇/水(5∶95;V∶V)，流速為 0.6 mL/min，檢測波長為210 nm的條件下，丙烯酰胺能夠在Agilent C18反相色譜柱中得到很好地保留和分離。該方法操作簡便，精密度高，穩(wěn)定性好，加標(biāo)回收率較高，符合痕量分析的要求，能夠很好地應(yīng)用于復(fù)合薯片中丙烯酰胺的相關(guān)研究，以便控制食品中丙烯酰胺含量，減少丙烯酰胺對健康的危害。

［1］TAREKE，RYDBERG PER，KARLSSON，et al.Analysis of acrylamide，a carcinogen formed in heated foodstuffs［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50:4998-5006.

［2］章宇.生物黃酮抑制食品中丙烯酰胺形成的機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系研究［D］.浙江:浙江大學(xué)，2008.ZHANG Yu.Studies on reduction mechanism and structure-activity relationship of acrylamide in foods by bio-flavonoids［D］.Zhejiang:Zhejiang University，2008.

［3］IARC.Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans［C］.Lyon France:International Agency for Research on Cancer，1994，60:389-433.

［4］CALLEMAN C J，BERGMARK E，STERN L G，et al.Anonlineardosimetric model for hemoglobin adduct formation by the neurotoxic agent acrylamide and its genotoxic metabolite glycidamide［J］.Environmental Health Perspectives，1993，99:221-223.

［5］STADLER R H，SCHOLZ G.Acrylamide:an update on current knowledge in analysis，levels in food，mechanisms of formation，and potential strategies of control［J］.Nutrition Reviews，2004，62(12):449-467.

［6］ALLEN B，ZEIGER E，LAWRENCE G，et al.Dose-response modeling of in vivo genotoxicity data for use in risk assessment:some approaches illustrated by an analysis of acrylamide［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2005，41(1):6-27.

［7］程靜.油炸食品中丙烯酰胺的安全性分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006.32(7):70-73.CHENG Jing.Food safety analysis of the acrylamide in fries［J］.Food and Fermentation Industries，2006，32(7):70-73.

［8］KALITA D，HOLM D G，JAYANTY S S.Role of polyphenols in acrylamide formation in the fried products of potato tubers with colored flesh［J］.Food Research International，2013，54:753-759.

［9］KARASEK LUBOMIR，WENZL THOMAS，ANKLAM ELKE.Determination of acrylamide in roasted chestnuts and chestnutbased foods by isotope dilution HPLC-MS/MS［J］.Food Chemistry，2009，114:1555-1558.

［10］吳衛(wèi)國，譚興和，熊興耀，等.不同工藝和馬鈴薯品種對馬鈴薯顆粒全粉品質(zhì)的影響［J］.中國糧油學(xué)報，2006，21(6):98-102.WU Weiguo，TAN Xinghe，XIONG Xingyao，et al.Processing technology and potato varieties vs property of potato granules［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2006，21(6):98-102.

［11］蔡智鳴，王振，史馨，等.油炸及燒烤食品中丙烯酰胺的HPLC測定［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，27(5):10-12.CAI Zhiming，WANG Zhen，SHI Xin，et al.HPLC determination of acrylamide in fried and barbecued food［J］.Journal of Tongji University(Medical Science)，2006，27(5):10-12.

［12］MULLA M Z，BHARADWWAJ V R，ANNAPURE U S，et al.Acrylamide content in fried chips prepared from irradiated and non-irradiated stored potatoes［J］.Food Chemistry，2011，127(4):1668-1672.

［13］王吉，李彧娜.固相萃取-高效液相色譜法檢測油炸薯?xiàng)l中丙烯酰胺［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2012，24(5):445-448.WANG Ji，LI Yuna.Determination of acrylamide in French fries using solid phase extraction and high performance liquid chromatography［J］.Chinese Journal of Food Hygiene，2012，24(5):445-448.

［14］章宇，焦晶晶，張英，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量［J］.中國食品學(xué)報，2007，7(1):131-137.ZHANG Yu，JIAO Jingjing，ZHANG Ying，et al.Determination of acrylamide in baked and fried foods by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2007，7(1):131-137.