伴有輔酶原位再生的胞外酶耦合法制備(R)-苯基乙二醇＊

彭益強，李漢林

(華僑大學工業(yè)生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建 廈門 361021)

做為手性化合物的苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑，也是制備具有光學活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體［1-3］。許多手性醇可以通過羰基還原酶(Carbonyl reductase，CR)對潛手性酮的立體選擇性還原得到［4，5］。羰基還原酶是輔酶依賴型的氧化還原酶，屬于短鏈脫氫/還原酶家族，其催化轉(zhuǎn)化過程依賴輔酶的連續(xù)供給［6，7］。目前羰基還原酶催化制備手性醇的生產(chǎn)一般采用細胞轉(zhuǎn)化法，目的是利用細胞自身的代謝為羰基還原酶的催化提供還原質(zhì)子［8］。為加強輔酶供給，也有將羰基還原酶表達基因與輔酶NADH普適性再生酶如甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)表達基因整合于同一質(zhì)粒中共表達于同一宿主細胞中進行全細胞法轉(zhuǎn)化［9，10］。

從工業(yè)生產(chǎn)的角度來講，細胞催化轉(zhuǎn)化法普遍存在著菌株培養(yǎng)條件復雜，生產(chǎn)過程的穩(wěn)定性與安全性易受滅菌情況的潛在威脅，在很多情況下產(chǎn)物從發(fā)酵液中提取分離的過程較復雜，生產(chǎn)廢液需進行環(huán)保處理等問題，而且發(fā)酵底物因細胞代謝途徑復雜等原因不全轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物，因此對產(chǎn)率的提高也是一種限制［11，12］。胞外酶催化法做為近年來在工業(yè)生物技術領域中極受關注的催化轉(zhuǎn)化法可以克服微生物細胞轉(zhuǎn)化法中存在的局限性，具有反應速率快，底物轉(zhuǎn)化較徹底，生產(chǎn)過程清潔和易于操作等特點［13］。本實驗室從近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis CICC1676)中經(jīng)誘變分離得到了產(chǎn)高立體選擇性的羰基還原酶(CRCp-9)的菌株，所產(chǎn)羰基還原酶能在體外將β-羥基苯乙酮不對稱的還原為(R)型苯基乙二醇。同時為了解決體外氧化還原酶催化過程中輔酶的供應問題，本文將甲酸脫氫酶 (Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)與之相耦合解決還原型輔酶I(NADH)持續(xù)供給問題，實現(xiàn)了立體醇的胞外酶法連續(xù)制備(圖1)。FDH是一種優(yōu)良且使用廣泛的NADH 循環(huán)利用再生物催化劑［14］，德國的 Kula［15］在2002年提出的HCOOH/FDH體系已成為還原型輔酶NADH酶法再生最成功的再生系統(tǒng)。本文通過比較體外單酶催化和雙酶耦合催化，構(gòu)建一個伴有輔酶再生的體外雙酶耦合催化體系連續(xù)制備立體醇手性化合物，為手性化合物的制備提供一個新型的催化轉(zhuǎn)化體系。

圖1 伴有輔酶再生與循環(huán)利用的CR/FDH耦合制備(R)-苯基乙二醇體系Fig.1 (R)-phenyl-1，2-ethanediol preparation system of CR/FDH with cofactor regeneration and recycling

1 材料與方法

1.1 菌株

近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis CICC1676)。

1.2 試劑、酶、緩沖液與培養(yǎng)基

氧化型輔酶I，還原型輔酶I(廈門泰京)，(S)-苯基乙二醇與(R)-苯基乙二醇(Sigma公司)，β-羥基苯乙酮(Aladdin Chemistry Co.Ltd)，乙酸乙酯(上海國藥);甲酸脫氫酶(恩瑞麗柏公司，最適反應pH8.0，pH 穩(wěn)定范圍6.0 ～9.0，最適反應溫度45 ℃，溫度穩(wěn)定范圍40～55℃);Tris-HCL緩沖液，Critic acid緩沖液，Gly-NaOH緩沖液，0.5 mmol/L的NADH溶液，5 mmol/L β-羥基苯乙酮溶液;LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸膏 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH自然)，MYPG斜面培養(yǎng)基(麥芽汁 1%，酵母粉0.3% ，蛋白胨 0.5% ，葡萄糖 1% ，瓊脂 2%)，液體培養(yǎng)基(葡萄糖3%，酵母粉0.5%，蛋白胨0.5%，Mg-SO4·7H2O 0.05%，K2HPO3·3H2O 0.1%，KH2PO30.1%)。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀HP1100(Agillent)，751型紫外可見光分光光度計(上海光譜)。

1.4 近平滑假絲酵母的活化與誘變培養(yǎng)

將保藏在LB培養(yǎng)基上的菌種活化，稀釋一定濃度后涂布于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)24 h，放在紫外燈下照射30 s后放入保溫箱培養(yǎng)，觀察菌株生長狀況。48 h后，將生長良好的菌株篩選出來，接種到斜面培養(yǎng)基上。挑取斜面生長細胞接種于100 mL液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，30℃搖床(200 r/min)培養(yǎng)24 h破碎細胞測定酶活，挑取酶活最大菌株繼續(xù)進行誘變篩選，共進行了5輪。

1.5 羰基還原酶液制備

斜面培養(yǎng)誘變后酶活最高菌株，挑取細胞接種于100 mL液體培養(yǎng)基，30℃搖床(200 r/min)培養(yǎng)24 h作為種子液。按5%的接種量將種子菌液接種于250 mL三角瓶中(含100 mL液體培養(yǎng)基)，搖床(200 r/min)中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。菌液在8000 r/min的條件下離心，離心后的酵母菌體分散于Tris-HCL(pH8.5，10 mmol/L)緩沖液中，每升中菌體含量約為100 g濕重，置于冰浴中進行超聲破碎(功率400 W，超聲4 s，間歇 12 s，超聲破碎 120 次)，然后于4℃下離心(12000 r/min，10 min)，所得上清液按文獻［7］方法進行離子交換層析快速分離純化即得羰基還原酶液，保藏待用。

1.6 羰基還原酶酶學性質(zhì)考查

1.6.1 最適pH與pH穩(wěn)定性的的測定 總反應體積為 2.5 mL，在不同 pH(3.0-11.0)的緩沖液中分別加入 0.5 mL 0.5 mmol/L NADH，0.5 mL 5 mmol/L底物 β-羥基苯乙酮，1.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鉀緩沖液，40℃水浴恒溫2 min，加入0.5 mL酶液啟動反應，測量340 nm處吸光度的變化，根據(jù)測定的吸光度變化數(shù)值計算酶活，考查pH對酶活的影響。將酶液分別在放置在不同的pH(3.0-9.0)緩沖液中靜置2 h后，相同測活體系測定剩余酶活以考察該酶的pH穩(wěn)定性。

1.6.2 最適反應溫度與溫度穩(wěn)定性的測定 測活體系如 1.6.1所示，分別在 pH7.0，不同的溫度(20-70℃)下水浴恒溫2 min，加入相同的酶量啟動反應，測量340 nm處吸光度的變化，根據(jù)測定的吸光度變化數(shù)值計算酶活，考查溫度對酶活的影響。分別取相同的酶液在不同的溫度下(10-70℃)保溫1 h后，相同測活體系測定剩余酶活以考察該酶的溫度穩(wěn)定性。

1.7 R-苯基乙二醇胞外酶催化制備

1.7.1 R-苯基乙二醇單酶催化制備 反應體系中含 0.07 g NAD+，加入 β-羥基苯乙酮2.9 mL(終濃度6 g/L)，然后加入磷酸鉀緩沖液7.1 mL，用漩渦混合器將整個反應體系混勻后加入0.5 mL的羰基還原酶，搖床微微震蕩充分反應，每隔0.5 h取樣測定底產(chǎn)物含量。

1.7.2 R-苯基乙二醇雙酶耦合催化制備 反應在50 mL反應器中進行。體系中含0.05 g NAD+，加入β-羥基苯乙酮溶液(終濃度6 g/L)和另一底物甲酸鈉溶液，然后加入磷酸鉀緩沖液定容。整個反應體系混勻后加入羰基還原酶液和甲酸脫氫酶液啟動耦合反應。搖床微微震蕩充分反應，每隔0.5 h取樣測定底產(chǎn)物含量。

1.8 分析方法

羰基還原酶酶活的測定:測活體系如1.6.1所述。酶活定義:在上述條件下，每分鐘催化還原1 μmol NADH的酶活力為1個酶活單位。每單位體積酶活計算公式如下:

其中，Vt:反應液總體積;Vs:抽提液樣品體積;△A:每分鐘吸光度變化值;K:樣品稀釋倍數(shù);ε:摩爾消光系數(shù)，數(shù)值為6.22。

底物β-羥基苯乙酮測量:參考文獻［16］的方法，β-羥基苯乙酮的羥基在240 nm處有著最大的紫外吸收峰，測定不同反應時間體系中β-羥基苯乙酮的吸光值，對照標準曲線，可計算出β-羥基苯乙酮的量。

產(chǎn)物 R-苯基乙二醇測定:參考文獻［15，17］方法，樣品液用一倍體積的乙酸乙酯萃取，萃取5 h，微孔過濾后有機相用液相色譜分析產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇光學純度及產(chǎn)率，計算相應產(chǎn)物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶液制備及催化實驗

經(jīng)過5輪誘變篩選，標號為9的菌株經(jīng)擴培發(fā)酵測得產(chǎn)羰基還原酶的酶活最高，此菌株編號為CP-9，單位體積酶活為1.9 U/mL(表1)。將此菌株擴培，細胞破碎后離心分離進行硫酸銨提取與離子交換層析快速分離純化，獲得純化倍數(shù)為11.5倍的羰基還原酶酶液(表2)。此羰基還原酶(CRCp-9)催化底物β-苯基乙二酮后產(chǎn)物經(jīng)鑒定為(R)-苯基乙二醇，說明篩選菌株產(chǎn)的羰基還原酶為(R)-專一性次級醇還原酶。

表1 產(chǎn)羰基還原酶的近平滑假絲酵母菌株誘變篩選Tab.1 Mutation and filtration of Candida parapsilosis producing carbonyl reductase

表2 羰基還原酶(CRCp-9)酶液的快速分離純化Tab.2 Quick purification of carbonyl reductase(CRCp-9)from Candida parapsilosis CICC1676

2.2 羰基還原酶酶學性質(zhì)的研究

2.2.1 最適pH值與pH穩(wěn)定性 根據(jù)不同pH下測得的吸光度值計算出相應的酶活，以最高酶活作為100%，計算出不同pH下的相對酶活，做相對酶活對pH值的變化曲線，如圖2所示。由圖可知，羰基還原酶(CRCp-9)催化還原β-羥基苯乙酮的最適pH值為6.5。同時測定在不同pH緩沖液保存一段時間后的酶液的酶活，以最高酶活為100%，做相對酶活對pH值的變化曲線，如圖3所示。由圖可知，該羰基還原酶具有較廣的pH穩(wěn)定范圍，在 pH4.0-8.0之間酶活相對比較穩(wěn)定。解睛等［18］從擬熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis C104)中分離篩選到的羰基還原酶還原反應最適 pH為6.0-6.5，耿亞維等［19］從近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis CTCCM 203011)中基因組中釣取新型(s)-羰基還原酶基因，在E.coli中構(gòu)建重組表達菌，最適反應pH為5.5，而羊明等［20］從近平滑假絲酵母 (Candida parapsilosis CCTCC 203011)分離到(R)-羰基還原酶，最適反應pH為6.0。由此可見不同來源的羰基還原酶最適反應pH較相似，但也存在一些差異，如催化(S)型與(R)型的不同，基因表達的性質(zhì)也有些變化。本文的目的是要在胞外與甲酸脫氫酶(最適反應pH為8.0)耦合構(gòu)建雙酶催化制備體系。催化體系要求雙酶的酶學性質(zhì)盡量相近，以保持雙酶體系具有較高的催化能力。由此可知兩酶的最適pH值還是有一定差別，但 CRCp-9的 pH 穩(wěn)定范圍為4.0-8.0，這為兩酶耦合反應設置較合適pH提供了條件。綜合兩酶性質(zhì)，設定耦合反應體系pH值為7.0。

圖2 羰基還原酶CRCp-9最適反應pHFig.2 Optimum pH of carbonyl reductase(CRCp-9)catalytic reaction

圖3 羰基還原酶CRCp-9pH穩(wěn)定性Fig.3 Effect of pH on carbonyl reductase(CRCp-9)stability

2.2.2 最適溫度與溫度穩(wěn)定性 根據(jù)不同溫度下測得的吸光度值計算出不同溫度一下的酶活，以最高酶活為100%，計算出不同溫度時的相對酶活。做酶活對反應溫度變化曲線，如圖4所示。如圖所示，酶催化還原反應的最適溫度為40℃。從各種微生物中純化所得到的羰基還原酶在催化反應是最適溫度不同，但大多都在30～40℃之間［18-20］。同時測定酶液在不同溫度下保藏一段時間后的酶活，以最高酶活為100%，做不同溫度下酶活變化曲線，如圖5所示。如圖所示，40℃下保存的酶活力損失不大，可保持原酶活的90%以上，說明該酶能耐受一定的溫度變化。但當溫度高于50℃時，酶蛋白的失活較為嚴重，在60～70℃之間，酶活近乎喪失。在與甲酸脫氫酶(最適反應溫度45℃，溫度穩(wěn)定范圍40～55℃)構(gòu)建耦合反應體系時，要求雙酶最適反應溫度盡量相近。從研究結(jié)果看，雙酶溫度穩(wěn)定性具有一定的交集，根據(jù)耦合反應要求，體系反應溫度可定為45℃。

圖4 羰基還原酶CRCp-9最適反應溫度Fig.4 Optimum temperature of carbonyl reductase(CRCp-9)catalytic reaction

2.3 羰基還原酶催化單反應

為了與伴有輔酶反復利用的雙酶耦合反應相比較，考查在沒有進行輔酶再生的情況下羰基還原酶轉(zhuǎn)化底物的效果。通過每0.5 h取樣，測定樣品中底產(chǎn)物量的變化，可得單酶催化反應中底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物生成的變化趨勢(圖6)。由圖6可見，在反應前1.5 h，底物苯乙酮和產(chǎn)物苯乙醇以較衡定的速率進行轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生(可由曲線的斜率判斷)，這是由于體系中輔酶NADH的量還可提供足夠的質(zhì)子還原力;反應進行2 h后，底產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生速率均趨近于零，反應達到一個平衡狀態(tài)，這是由于輔酶量逐漸消耗，己不足以維持酶的還原反應。因此批次單酶催化反應平衡時間為2.5 h，底物未能完全轉(zhuǎn)化，底物轉(zhuǎn)化率為25%，同時測定產(chǎn)物(R)-苯基乙二酮的ee值為98.6%。這是由于胞外純酶催化，消除了胞內(nèi)轉(zhuǎn)化時其它酶的干擾，可以得到更高純度的立體醇［21］。

圖5 羰基還原酶CRCp-9溫度穩(wěn)定性Fig.5 Effect of temperature on carbonyl reductase(CRCp-9)Stability

圖6 羰基還原酶CRCp-9單反應轉(zhuǎn)化 β-羥基苯乙酮過程Fig.6 Translation process of β-hydroxyacetophenone by carbonyl reductase single catalyse

2.4 (R)-苯基乙二醇的胞外耦合酶法制備

在CRCp-9轉(zhuǎn)化苯乙酮反應中耦合NADH再生酶-甲酸脫氫酶以解決反應所需還原力問題。在耦合體系反應過程中每0.5-1 h取樣測定底產(chǎn)物的量，獲得CR/FDH耦合反應中底產(chǎn)物變化趨勢圖(圖7)。由圖7可見，雖然耦合體系中NAD+的量較之單反應的還少，但由于FDH的輔酶再生作用，可為CR的還原反應提供持續(xù)的還原力，保證了CR還原反應的連續(xù)進行。反應平衡時底物苯乙酮轉(zhuǎn)化率較單反應有較大提高，達到了95.4%(底物轉(zhuǎn)化率未達100%的原因可能與酶耦合反應條件，底產(chǎn)物抑制和酶活存在半衰期等有關)，產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇得率為93%，產(chǎn)物ee值達98.6%。由于在胞外進行單一純酶催化，同時利用專一性的輔酶再生酶解決輔酶持續(xù)供給問題，伴有輔酶循環(huán)利用的胞外耦合催化法獲得了較高的轉(zhuǎn)化率和較高的光學純度e.e.值，輔酶的總轉(zhuǎn)化數(shù)為267。從工業(yè)生產(chǎn)角度更注重轉(zhuǎn)化體系的生產(chǎn)能力(productivity)，胞外CR/FDH耦合體系批次反應平衡時間為7 h(圖7)，生產(chǎn)能力達0.8 g/L/h，較相似的細胞轉(zhuǎn)化法的生產(chǎn)能力有較大的提高［22］。

圖7 CR/FDH耦合反應轉(zhuǎn)化β-羥基苯乙酮過程Fig.7 Translation process of β-hydroxyacetophenone by CR/FDH coupling reaction

3 結(jié)論

實驗室保藏的近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis CICC1676)經(jīng)5輪誘變篩選獲得具(R)-專一性羰基還原酶CRCp-9，經(jīng)快速分離純化獲得純化倍數(shù)為11.5倍的酶液，其最適反應pH為6.5，pH穩(wěn)定范圍為4.0-8.0，最適反應溫度為40℃，溫度穩(wěn)定范圍為30-45℃，與甲酸脫氫酶(FDH)最適pH與最適反應溫度較接近，有利于耦合構(gòu)建伴有輔酶再生與循環(huán)利用的CR/FDH雙酶連續(xù)催化反應。與CRCp-9單酶轉(zhuǎn)化底物反應相比較，CR/FDH耦合體系轉(zhuǎn)化時間延長，底物β-羥基苯乙酮轉(zhuǎn)化更徹底，轉(zhuǎn)化率提高到95.4%，產(chǎn)物(R)-苯基乙二醇得率也提高到93%，產(chǎn)物 e.e.值達 98.6% ，輔酶總轉(zhuǎn)化數(shù)(TTN)為 267。與相類似轉(zhuǎn)化反應的細胞轉(zhuǎn)化法相比，也具備較好的耦合體系生產(chǎn)能力，批式生產(chǎn)能力達0.8 g/L/h。胞外雙酶耦合催化法解決了立體醇酶法催化制備過程中輔酶再生與循環(huán)利用問題并表現(xiàn)出了較高的生產(chǎn)能力，為立體醇等手性化合物的工業(yè)生產(chǎn)提供了一種新型、有效的制備體系。

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