以葉酸偶聯(lián)納米Fe3O4顆粒的合成和標記腫瘤實驗研究＊

胡 豐，唐寧寧，劉 燦，唐園園，王少華，尹朝奇，周春姣，周建大，曾 蔚

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長沙 410013;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙 410128;3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院/湘雅博愛康復(fù)醫(yī)院手術(shù)中心，湖南長沙 410008)

由于腫瘤細胞的細胞膜和Fe3O4納米顆粒都帶負電荷，影響了腫瘤細胞對Fe3O4納米顆粒的攝取，所以不經(jīng)表面修飾的Fe3O4納米顆粒難以有效標記腫瘤細胞。為實現(xiàn)Fe3O4納米顆粒對腫瘤細胞的有效標記，可以將Fe3O4顆粒和與目標腫瘤細胞具有高度親和力的特異性靶向分子進行偶聯(lián)［1-3］。已有不少特異性靶向分子成功用于標記腫瘤細胞的報導(dǎo)［4-9］，如單克隆抗體、蛋白質(zhì)及多肽。但這些方法存在諸如價格昂貴、抗體分子量過大導(dǎo)致偶聯(lián)后的Fe3O4納米顆粒難以穿過生物屏障等缺點［10］。葉酸是一種人體必需的小分子維生素，是DNA合成過程中的重要輔酶以及機體多種酶系統(tǒng)的必須輔助因子。與抗體等蛋白質(zhì)靶向分子相比較，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價格低廉、無免疫原性等優(yōu)點，且葉酸與葉酸受體之間具有很強的結(jié)合力，能通過配體-受體結(jié)合作用被高效介導(dǎo)進入腫瘤細胞，是一種頗有應(yīng)用前景的靶向物質(zhì)［11-12］。

本文利用葉酸與葉酸受體高度親和的特性，將3-氨基丙基-3-乙氧基硅烷(APTES)修飾的超順磁Fe3O4納米顆粒與葉酸偶聯(lián)，使葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒介導(dǎo)進入肝癌細胞，以瘤鼠為動物模型，考察了葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒的活體肝癌細胞標記效果和MRI成像功能。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑:六水三氯化鐵(FeCl3·6H2O，北京化學(xué)試劑公司);七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O，北京化學(xué)試劑公司);十二烷基苯磺酸鈉(DBS，北京化學(xué)試劑公司);葉酸(北京化學(xué)試劑公司);二甲基亞砜(DMSO，北京化學(xué)試劑公司);二甲苯(北京化學(xué)試劑公司);3-氨基丙基-3-乙氧基硅烷(ATPES，上?；瘜W(xué)試劑公司;3-二甲胺基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl，上海化學(xué)試劑公司);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，上?；瘜W(xué)試劑公司);戊巴比妥鈉進口分裝(上?；瘜W(xué)試劑公司)，均為分析純。RPMll640(美國Gibco公司);人皮膚成纖維細胞株HSF(中國湖南省計生委陳勇博士惠贈)，SRB(美國Sigma公司)，本實驗采用的雄性Wistar大鼠，體重約180 g，來自中南大學(xué)實驗動物中心。

儀器:Mill-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);MD34透析袋(8000，上海源葉生物科技有限公司);DJ1C增力電動攪拌器(江蘇大地自動化儀器廠);TG16高速離心機(長沙英泰儀器有限公司);KQ-300Z超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BCD-216KD冰箱(海爾公司);DZF-6050真空干燥器(上海精密實驗設(shè)備有限公司);D8X-射線衍射儀(德國Bruker公司);JEM-3010透射電鏡(日本JEOL公司制造);WQF 410紅外光譜儀(北京第二光學(xué)儀器廠);VSM 7300(美國 Lakeshore公司);HPPS-ET 5002動態(tài)光散射儀(英國Malvern Instruments公司);Carl Zeiss AXIO OBSERVER AI熒光倒置顯微鏡(德國蔡司公司);Avanto 1.5T磁共振成像儀(德國西門子公司)。

1.2 APTES修飾的超順磁 Fe3O4納米顆粒的合成

25mL超純水通高純氬氣除氧，高速攪拌下加入FeSO4·7H2O(2 mmoL)和 FeCl3·6H2O(4 mmoL)，溶解完全后，再加入15.8mL DBS溶液(25 mmol/L)和75mL二甲苯，高速攪拌10 min讓溶液混合均勻，加入1 mol/L NaOH溶液調(diào) pH值至8-9，繼續(xù)攪拌30 min，混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層。分掉下層水層，上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，通氬氣除氧，緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分二甲苯，然后回流30 min，降溫至室溫。加入適量的ATPES和丙酮，超聲30 min，借助外磁場分離，用超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析袋透析后分散于超純水中，得到ATPES修飾的Fe3O4納米顆粒。

1.3 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的合成

0.3 mmoL葉酸溶于10mL DMSO中，超聲10 min后，加入 0.3 mmoL NHS 和 0.3 mmoL EDC.HCl和5mL ATPES修飾的Fe3O4納米顆粒(含5 mg Fe3O4納米顆粒)，超聲20 min后，攪拌過夜?；旌先芤航柚獯艌龇蛛x，超純水和無水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析袋透析后分散于超純水中，得到葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒。

1.4 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的表征

XRD表征:用Bruker D8X-射線衍射儀對樣品的結(jié)構(gòu)進行分析。掃描電壓40 kV，掃描電流40 mA。連續(xù)掃描，0.25 °/min，采樣間隔 0.02 °。

TEM表征:樣品真空干燥前取一滴，滴于微柵上，室溫干燥后用JEM-3010透射電鏡進行表征。

FTIR表征:先取少量真空干燥后的樣品粉末與KBr混研，然后壓片，用WQF 410紅外光譜儀進行表征，分辨率4 cm-1，重復(fù)掃描32次。

磁性能表征:樣品的磁性能采用VSM 7300震動樣品磁強計進行表征。

DLS表征:葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒的粒徑分布采用動態(tài)光散射儀(DLS)HPPS-ET 5002進行測量，光源為He-Ne激光(λ=632.8 nm)。采用背散射模式采集數(shù)據(jù)，操作溫度為25±0.1℃。

1.5 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒初步安全性評價

經(jīng)鼠尾靜脈注入葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒后，連續(xù)3天觀察Wistar大鼠的活動情況、死亡情況和處死后主要臟器損傷情況，觀察葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的急性毒副作用，以初步評價其安全性。

1.6 SRB法檢測葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒細胞安全試驗［13］

1.6.1 細胞培養(yǎng)與24孔板染毒 取對數(shù)生長期的人皮膚成纖維細胞系HSF，用含150mL/L滅活新生小牛血清的RPMll640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×109/L，加于24孔板的第1列孔中，每孔0.2mL，分為加入葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒及對照組生理鹽水等量約0.2mL，每組細胞均設(shè)12個平行孔，復(fù)種4板。

1.6.2 SRB實驗 24孔板中細胞貼壁棄液后，每孔輕柔加入50μL經(jīng)4℃預(yù)冷的500mL/L三氯醋酸，使終濃度為100mL/L，置于4℃冰箱1 h，自來水洗5次除去三氯醋酸、培養(yǎng)液、低分子量代謝物、血清蛋白，空氣干燥后，加4 g/L SRB染色20～30 min，用醋酸洗滌3遍，干燥后，加入10 mmol/L Tris液200μL溶解，于波長515 nm處，酶聯(lián)免疫檢測儀測定A值。

1.7 活體腫瘤細胞標記

瘤鼠荷人肝癌皮下移植瘤動物模型的建立:將人肝癌Bel 7402細胞株(由中南大學(xué)實驗動物中心提供)制成5×107/mL細胞懸液，用帶7號針頭的注射器抽取0.2mL約含1×107個活細胞的懸液，接種于Wistar大鼠左側(cè)前腿皮下，建立瘤鼠模型。瘤鼠在標準超凈環(huán)境下飼養(yǎng)約1-2周，待皮下腫瘤長至5 mm3時開始用于活體肝癌細胞標記實驗。瘤鼠經(jīng)3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，對其腿部進行MRI平掃，得到瘤鼠腿部的平掃T2WI成像圖。然后對同一只瘤鼠尾靜脈注射葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒，注射量為0.4 mg Fe/kg體重，40 min后使用相同參數(shù)掃描相同部位，得到增強T2WI成像圖以進行比較腫瘤檢出情況。

1.8 病理學(xué)檢查

MRI檢查完成后，迅速處死動物，切除腫瘤，觀察腫瘤生長、浸潤情況。用10%福爾馬林固定標本、石蠟包埋，連續(xù)切片，隔4取1，片厚7μm。每個組織塊各取2套切片，分別行蘇木素-伊紅染色和普魯士藍染色，觀察腫瘤組織光鏡下形態(tài)及組織內(nèi)含F(xiàn)e情況。

2 結(jié)果

2.1 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的表征結(jié)果

用XRD對葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒進行表征。圖1為葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒的XRD圖。圖中 在 2θ 值 為 30.1°、35.4°、43.1°、53.2°57.0°、62.7°和 74.0°處出現(xiàn)了 7 個衍射峰，分別對應(yīng)于立方相 Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)和(533)晶面。這些衍射峰的位置和相對強度與標準卡片(JCSPD No.82-1533)能很好地匹配。圖中并沒有其它雜質(zhì)峰的存在，說明葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒為純相的立方相結(jié)構(gòu)。按謝樂公式估算，粒徑約8 nm。

圖1 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的XRD圖Fig.1 XRD patterns of folic acid-coupling superparamagnetic Fe3O4nanoparticles

葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的TEM圖如圖2所示。從圖2可以看出，大部分納米顆粒呈近似球形，初步估算出顆粒的平均粒徑約為8 nm左右，與XRD估算結(jié)果相符。

葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的表面基團以FTIR進行表征。其結(jié)果如圖3所示。圖中596 cm-1和445 cm-1處的吸收峰歸于Fe-O鍵的特征吸收。1643 cm-1的吸收可歸N-H的彎曲振動，也是分子中存在伯胺的有利證據(jù)。1604cm-1吸收對應(yīng)于葉酸分子中芳環(huán)的伸縮振動，1396 cm-1的吸收則對應(yīng)于葉酸分子中苯甲酸的振動，1533 cm-1處的吸收可歸于酰胺的特征吸收。紅外數(shù)據(jù)證明葉酸分子成功地偶聯(lián)到了Fe3O4納米顆粒的表面。

圖2 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的TEM圖Fig.2 TEM image of folic acid-coupling superparamagnetic Fe3O4nanoparticles

圖3 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的FTIR圖Fig.3 FTIR image of folic acid-coupling superparamagnetic Fe3O4nanoparticles

葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的磁滯回線見圖4。從圖4可以看出，其磁滯回線經(jīng)過原點，且矯頑力和剩磁接近零，說明葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒呈超順磁特性。飽和磁化強度為51 emu/g Fe。

葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的粒徑分布結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的粒徑分布比較窄，平均粒徑約25.7 nm。

2.2 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的初步安全性評價結(jié)果

Wistar大鼠體內(nèi)急性毒性試驗結(jié)果表明:經(jīng)鼠尾靜脈注入葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒后3天內(nèi)Wistar大鼠活動無異常，無一死亡，且處死后主要臟器未見明顯異常，兩組無明顯差異。

圖4 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的磁滯回線圖Fig.4 Magnetic hysteresis loop of superparamagnetic Fe3O4nanoparticles

圖5 葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒的粒徑分布Fig.5 The particle size distribution of super-paramagnetic Fe3O4nanoparticles

2.3 SRB法檢測葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒細胞安全試驗結(jié)果

SRB法檢測葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒細胞安全試驗結(jié)果如表1所示。

表1 SRB法測定葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒對HSF生長的影響結(jié)果Tab.1 Effect of folic acid-coupling Fe3O4nanoparticles on the growth of human skin fibroblasts by SRB assay

經(jīng)兩組隨機樣本 t檢驗，P＜0.01，說明 Fe3O4組和對照組對HSF的生長影響無統(tǒng)計學(xué)差異。

SRB法檢測葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒細胞安全試驗結(jié)果顯示葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒對人皮膚成纖維細胞(HSF)的生長與生理鹽水對照組的影響一樣，無明顯抑制細胞生長的表現(xiàn)，經(jīng)統(tǒng)計分析得出任意兩組無統(tǒng)計學(xué)差異，可以認為葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒對人皮膚成纖維細胞(HSF)無明顯毒性作用。

2.4 腫瘤細胞標記結(jié)果

圖6為(a)瘤鼠腿部的平掃T2WI成像圖和(b)注射葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒之后40 min的瘤鼠腿部的增強T2WI成像圖(箭頭所指的位置為腫瘤部位)。從圖6(a)和圖6(b)可以看出，在瘤鼠腿部的MRI的平掃T2WI像中，腫瘤部位與周圍正常組織之間的MRI信號無明顯區(qū)別，很難發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在。但瘤鼠腿部的增強T2WI像中，腫瘤部位與周圍正常組織之間MRI信號對比非常明顯，MRI掃描時能明顯發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在。主要原因是Fe3O4納米顆粒與葉酸偶聯(lián)后，能與腫瘤細胞中高度表達的葉酸受體結(jié)合，將葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒轉(zhuǎn)入腫瘤細胞內(nèi)，對腫瘤細胞進行標記，使得標記的腫瘤部位的MRI成像T2信號有明顯的負增強。這樣就增加了正常組織和標記的腫瘤之間的成像對比，標記的腫瘤部位就顯得清晰可見。

瘤鼠荷人肝癌皮下移植瘤動物模型完成MRI成像及其它相關(guān)實驗后，然后進行組織病理學(xué)相關(guān)檢查，包括常規(guī)HE染色及普魯士藍染色。常規(guī)HE染色結(jié)果表明所建立的瘤鼠荷人肝癌皮下移植瘤動物模型符合肝細胞癌。普魯士藍染色結(jié)果如圖7所示。普魯士藍染色結(jié)果中可以看出，肝癌細胞內(nèi)能明顯看見較多的藍染的顆粒，藍染顆粒代表經(jīng)葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒。普魯士藍染色從病理學(xué)上驗證了肝癌細胞內(nèi)有Fe(即葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒)的存在，證明葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒通過葉酸與葉酸受體的高度親和力轉(zhuǎn)入了肝癌細胞內(nèi)，能對肝癌細胞進行活體標記，表明葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒對瘤鼠荷人肝癌移植瘤具有靶向標記效果。

3 討論與結(jié)論

圖6 (a)瘤鼠腿部的平掃T2WI成像圖和 (b)注射葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒之后的瘤鼠腿部的增強T2WI成像圖(箭頭所指的位置為腫瘤部位)Fig.6 The unenhanced T2WI image of the leg of tumor-bearing rats(a)and the enhanced T2WI image of the leg of tumor-bearing rats at 40 minutes after injection of folic acid-modified Fe3O4nanoparticles(b).Arrows refer to the position of the tumor

葉酸受體在正常動物細胞中表達高度保守，其原因是正常動物細胞缺乏葉酸生物合成的關(guān)鍵酶，所以只能依靠細胞表面的葉酸受體主動攝取外源性葉酸來維持正常的生命活動。但葉酸受體在很多惡性腫瘤中如卵巢癌、鼻咽癌、腎癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、肝癌等腫瘤細胞表面過度表達。由于葉酸受體在動物惡性腫瘤細胞表面過度表達、且對葉酸及葉酸類似物具有很高的親和力和特異性等特點，可通過特異性結(jié)合介導(dǎo)葉酸及葉酸類物質(zhì)內(nèi)吞進入腫瘤細胞。所以，葉酸是一種極具潛能的腫瘤靶向分子［14-16］。

本實驗利用價格低廉且環(huán)境友好的鐵鹽、十二烷基苯磺酸鈉和3-氨基丙基3-乙氧基硅烷為原料，合成了APTES修飾的Fe3O4納米顆粒，通過偶聯(lián)劑與葉酸偶聯(lián)，合成了葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒。表征結(jié)果表明所制備的葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒為立方相的Fe3O4，粒徑約8 nm左右，水合直徑25.7 nm，呈近似球形，表面分布有羧基等功能基團，呈超順磁特性，飽和磁化強度為51 emu/g Fe。

葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒對人皮膚成纖維細胞(HSF)的生長無明顯抑制，對Wistar大鼠無明顯的急性毒副作用，安全程度較高。

圖7 瘤鼠腫瘤組織的普魯士藍染色結(jié)果(×400)Fig.7 Prussian blue staining of tumor tissue(×400)

Fe3O4納米顆粒與葉酸偶聯(lián)后，能與腫瘤細胞中高度表達的葉酸受體結(jié)合，將葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒轉(zhuǎn)入腫瘤細胞內(nèi)，對腫瘤細胞進行標記，使得標記的腫瘤部位的MRI成像T2信號有明顯的負增強。這樣就增加了正常組織和標記的腫瘤之間的成像對比，使得標記的腫瘤部位顯得清晰可見。通過常規(guī)HE染色檢測和普魯士藍染色，驗證了葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒對瘤鼠荷人肝癌移植瘤具有靶向標記效果。

因此，葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒的制備方法簡單易行，利用葉酸與葉酸受體的高度親和力，可將葉酸偶聯(lián)的Fe3O4納米顆粒有效轉(zhuǎn)導(dǎo)進入腫瘤細胞內(nèi)，可對腫瘤細胞進行活體標記，有利于腫瘤細胞的示蹤，是一種很有應(yīng)用前景的腫瘤細胞靶向物質(zhì)。

［1］LIU Z，PENG R.Inorganic nanomaterials for tumor angiogenesis imaging［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2010，37(1):147-163.

［2］LIM E K，KIM H O，JANG E，et al.Hyaluronan-modified magnetic nanoclusters for detection of CD44-overexpressing breast cancer by MR imaging［J］.Biomaterials，2011，32(31):7941-7950.

［3］YAN C，WU Y，F(xiàn)ENG J，et al.Anti-αvβ3 antibody guided three-step pretargeting approach using magnetoliposomes for molecular magnetic resonance imaging of breast cancer angiogenesis［J］.Int J Nanomedicine，2013，8:245-255.

［4］YONG K T.Anti-claudin-4-Conjugated highly luminescent nanoparticles as biological labels for pancreatic cancer sensing ［J］.Methods Mol Biol，2011，762:427-438.

［5］WU Y，CHU M，SHI B，et al.A novel magneto-fluorescent Nano-bioprobe for cancer cell targeting，imaging and collection［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，163(7):813-825.

［6］POSELT E，SCHMIDTKE C，F(xiàn)ISCHER S，et al.Tailor-Made quantum dot and iron oxide based contrast agents for in vitro and in vivo tumor imaging［J］.ACS NANO，2012，6(4):3346-3355.

［7］CHOI K Y，JEON E J，YOON H Y，et al.Theranostic nanoparticles based on PEGylated hyaluronic acid for the diagnosis，therapy and monitoring of colon cancer［J］.Biomaterials，2012，33(26):6186-6193.

［8］CHEN H，WANG L，YU Q，et al.Anti-HER2 antibody and ScFvEGFR-conjugated antifouling magnetic iron oxide nanoparticles for targeting and magnetic resonance imaging of breast cancer［J］.Int J Nanomedicine，2013，8:3781-3794.

［9］LI J，HE Y，SUN W，et al.Hyaluronic acid-modified hydrothermally synthesized iron oxide nanoparticles for targeted tumor MR imaging［J］.Biomaterials，2014，35(11):3666-77.

［10］MCNEIL S E.Nanotechnology for the biologist［J］.J Leukoc Biol，2005，78:585-594.

［11］ZHAI G，WU J，XIANG G，et al.Preparation，characterization and pharmacokinetics of folate receptor-targeted liposomes for docetaxel delivery ［J］.J Nanosci Nanotechnol，2009，9(3):2155-2161.

［12］PRABAHARAN M，GRAILER J J，PILLA S，et al.Folateconjugated amphiphilic hyperbranched block copolymers based on Boltorn H40，poly(L-lactide)and poly(ethylene glycol)for tumor-targeted drug delivery［J］.Biomaterials，2009，(30)16:3009-3019.

［13］ZHOU C J，WANG S H，ZHOU Y，et al.Folate-conjugated Fe3O4nanoparticles for in vivo tumor labeling［J］.Trans Nonferrous Met Soc China，2013，(7):2079-2084.

［14］MüLLER C，VLAHOV I R，SANTHAPURAM H K，et al.Tumor targeting using 67Ga-DOTA-Bz-folate investigations of methods to improve the tissue distribution of radiofolates［J］.Nucl Med Biol，2011，38(5):715-723.

［15］SULISTIO A，LOWENTHAL J，BLENCOWE A，et al.Folic acid conjugated amino acid-based star polymers for active targeting of cancer cells［J］.Biomacromolecules，2011，12(10):3469-3477.

［16］GAO W，XIANG B，MENG T T，et al.Chemotherapeutic drug delivery to cancer cells using a combination of folate targeting and tumor microenvironment-sensitive polypeptides［J］.Biomaterials，2013，34(16):4137-4149.