MTT方法的優(yōu)化＊

羅奇志，林 琳，王芙艷，余 平

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖南 長沙，410008)

很多方法都可用于檢測細(xì)胞增殖及活性，如同位素?fù)饺敕ǎ?，2］、乳酸脫氫酶釋放法［3，4］、流式細(xì)胞儀檢測法［5，6］等。MTT 法靈敏度高、操作簡便，其檢測結(jié)果與同位素?fù)饺敕ㄓ辛己玫囊恢滦缘珶o放射性污染，故廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、觀察細(xì)胞因子對細(xì)胞增殖的影響、抗腫瘤藥物的體外篩選等研究［7-10］。但常規(guī)MTT法也有不足，尤其是檢測懸浮細(xì)胞時影響因素多，重復(fù)性較差。人白血病K562細(xì)胞常用于血液腫瘤的體外研究，并且在自然殺細(xì)胞試驗(yàn)中廣泛用作靶細(xì)胞。本文以K562細(xì)胞為模型，對MTT法的主要影響因素進(jìn)行篩選，以建立適于測定K562細(xì)胞活性的優(yōu)化的MTT方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

K562細(xì)胞為本室長期保存。以含有10%新生牛血清(杭州四季青)的1640(Gibco)于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，臺盼藍(lán)染色計數(shù)，活性＞95%，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度備用。

1.2 主要試劑

MTT(Sigma)溶于1×PBS(PH 7.4)為5 mg/mL，0.22 μm濾過除菌后分裝，避光凍存于－20℃;二甲基亞砜(DMSO，Sigma);酸化異丙醇(用 HCl配成0.04 mol/L);三聯(lián)溶液(100 mL H2O中加入10 g十二烷基磺酸鈉、0.1 mL 10 mol/L的HCl及5 mL異丁醇)。

1.3 MTT法測定K562細(xì)胞增殖活性的條件篩選

取96孔培養(yǎng)板，四周培養(yǎng)孔不作為試驗(yàn)孔，僅加入PBS 200 μL/孔，余孔按如下條件種板:取K562細(xì)胞依次稀釋為 3.2 ×108、1.6 ×108、0.8 × 108、0.4× 108、0.2 × 108、0.1 × 108/L，分別取 100 μL 加入96孔板，每一篩選條件均設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基孔為空白調(diào)零孔。向各板上各組濃度梯度復(fù)孔中分別加入 MTT 5、10、20、30 或 40 μL/孔，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)4 h后取出，分別按(1)離心去除上清:取96孔板置孔板離心機(jī)上，4000 r/min離心10 min后小心棄去各孔上清，分別加入DMSO或酸化異丙醇100 μL/孔;(2)保留上清:另取培養(yǎng)好的96孔板，直接向各孔中加入三聯(lián)溶液100 μL/孔;將培養(yǎng)板置脫色搖床上震蕩，分別于10 min、2 h、12 h、24 h 后測定各培養(yǎng)孔 OD570，校正波長選630 nm;并于倒置相差顯微鏡下觀察formazan(甲臢)結(jié)晶和蛋白沉淀形成情況。

2 結(jié)果

2.1 MTT用量對測定結(jié)果的影響

本試驗(yàn)中選取五種MTT加入量，對應(yīng)的MTT終濃度分別為 0.238、0.455、0.833、1.154 及 1.429 mg/mL。倒置相差顯微鏡下觀察各試驗(yàn)孔中均有藍(lán)紫色甲臢結(jié)晶形成，形成量無明顯差異;在加入不同溶劑后檢測各孔OD值，由圖1可看出，隨著MTT終濃度增大，所測得OD值呈升高趨勢;但當(dāng)MTT加入量﹥20 μL/孔時，隨著MTT終濃度增大，所測得OD值略有下降。

圖1 MTT用量與OD值的關(guān)系(細(xì)胞濃度1.6×108/L)Fig.1 Relation between MTT concentration and absorbance(cell concentration 1.6 ×108/L)

2.2 細(xì)胞濃度對測定結(jié)果的影響

由圖2可看出，隨著細(xì)胞濃度增大，所測得的OD值增高，兩者之間呈正相關(guān);當(dāng)細(xì)胞濃度處于0.8×108～ 0.2×108/L時，相關(guān)系數(shù)達(dá) 0.997(DMSO組，10 min，P ＜ 0.01)、0.985(酸化異丙醇組，2 h，P＜0.01)和 0.998(三聯(lián)溶液組，12 h，P ＜0.01)。

圖2 細(xì)胞濃度與OD值的關(guān)系Fig.2 Relation between cell concentration and absorbance

2.3 離心去上清對測定結(jié)果的影響

本實(shí)驗(yàn)中采用了三種常用甲臢溶劑，其中DMSO及酸化異丙醇在加入前需先去除培養(yǎng)孔內(nèi)上清。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無論是采用倒扣培養(yǎng)板法還是逐孔吸出法去除培養(yǎng)上清，總會有少量甲臢結(jié)晶損失。經(jīng)測定各重復(fù)孔OD570值也證實(shí)，去除上清后各重復(fù)孔的CV值在0.08左右;而未去除上清的(三聯(lián)溶液組)重復(fù)孔CV值不高于0.05。

2.4 不同溶劑、不同作用時間對測定結(jié)果的影響

在分別加入三種甲臢溶劑后的不同時間，鏡下觀察可見DMSO組各孔內(nèi)甲臢結(jié)晶迅速溶解，10 min已溶解完全，隨著時間延長，各孔顏色逐漸加深，但未見明顯蛋白沉淀;酸化異丙醇組各孔內(nèi)甲臢結(jié)晶在30 min內(nèi)溶解完全，隨著時間延長，各孔顏色逐漸變淺，且出現(xiàn)逐漸增多的絮狀沉淀;三聯(lián)液組各孔內(nèi)甲臢結(jié)晶在12 h內(nèi)完全溶解，隨著時間延長，各孔顏色無明顯改變，且未見明顯蛋白沉淀。分別于加入三種甲臢溶劑后10 min、2 h、12 h、24 h測定各培養(yǎng)孔OD570可見，DMSO組OD570值在2 h之內(nèi)無明顯變化;酸化異丙醇組在各時間點(diǎn)測得OD570值有較明顯波動;三聯(lián)液組在12 h之后所測得的OD570值無明顯變化(圖3)。

圖3 不同溶劑、不同作用時間與OD值的關(guān)系Fig.3 Relation between solution and absorbance at different time point

3 討論

基于細(xì)胞能量代謝水平與DNA合成水平相平行的原理，Mosmann于1983年首創(chuàng)四唑鹽比色法(MTT法)用于檢測IL-2的生物學(xué)活性［11］。MTT法因其簡單、快速、敏感性好等而廣泛應(yīng)用于臨床和科研，同時，針對MTT法重復(fù)性較差、結(jié)果精確度易受甲臢溶劑不穩(wěn)定性的影響等缺點(diǎn)，研究者們在不斷對特定實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行改良優(yōu)化及拓展其應(yīng)用［12-16］。本實(shí)驗(yàn)以K562為實(shí)驗(yàn)對象，對使用MTT法檢測懸浮細(xì)胞增殖活性的相關(guān)影響因素進(jìn)行篩選優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 μL/孔細(xì)胞培養(yǎng)體系中5 mg/mL的MTT用量以不超過20 μL/孔為宜;為保證甲臢結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)呈良好線性關(guān)系，待測細(xì)胞濃度應(yīng)取0.8×108～0.2×108/L。DMSO、酸化異丙醇及三聯(lián)溶液是最為常用的三種甲臢溶劑，前兩者更多應(yīng)用于貼壁細(xì)胞，但在本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，由于在加入這兩種溶劑之前需要先去除培養(yǎng)孔中上清，盡管使用了孔板離心機(jī)離心，仍舊不能避免細(xì)胞及甲臢結(jié)晶的損失，因而影響孔間重復(fù)性及結(jié)果精密度;而采用三聯(lián)溶液不需去除原培養(yǎng)上清，檢測效果更好。在檢測時間上，DMSO、酸化異丙醇因能迅速溶解甲臢結(jié)晶而具有檢測時間短的優(yōu)勢，尤其是DMSO，10 min即可上機(jī)檢測，酸化異丙醇需在加入后30 min左右檢測;但兩種溶劑的穩(wěn)定性有限，DMSO需在2 h之內(nèi)檢測，酸化異丙醇則很快褪色，且產(chǎn)生蛋白沉淀影響結(jié)果測定。三聯(lián)溶液的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于前兩者，但需要反應(yīng)過夜(12 h)后才能檢測。因此，在檢測懸浮細(xì)胞K562的增殖活性時，若不考慮時間成本，建議選擇三聯(lián)溶液作為甲臢溶劑;若需快速獲得結(jié)果，建議選擇DMSO作為甲臢溶劑。

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