18F標(biāo)記的新型鏻正陽離子PET心肌灌注顯像劑的制備及生物性能評價

彭 程，趙祚全，陳淑婷，馬云川，張現(xiàn)忠，陸 潔

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053；2.放射性藥物教育部重點實驗室 北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，北京 100875； 3.分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門 361005； 4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037 )

心肌灌注核素顯像作為一種無創(chuàng)診斷技術(shù)，在冠心病的早期診斷及預(yù)后評價中起著重要的作用，相較于目前臨床廣泛使用的單光子計算機斷層掃描(SPECT)心肌灌注顯像技術(shù)，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)具有時間空間分辨率高、靈敏度高和心肌灌注定量等優(yōu)點[1]。但目前可用于臨床使用的PET心肌灌注顯像劑普遍核素半衰期過短，例如：13N-NH3·H2O(T1/2=10 min),82Rb(T1/2=75 s)，H215O(T1/2=2 min)，極大地限制了在臨床上的廣泛推廣[2-3]。因此，具有適宜核素半衰期的18F(T1/2=110 min)標(biāo)記新型PET心肌灌注顯像劑的研究成為近年來放射性藥物研究領(lǐng)域的一個新的熱點。

線粒體在細(xì)胞能量產(chǎn)生過程中起著非常重要的作用，線粒體的數(shù)量與細(xì)胞的能量需求有關(guān)，新陳代謝活躍的器官，如心臟，其細(xì)胞內(nèi)線粒體的重量約占30%。因而，許多新型PET心肌灌注顯像劑,例如18F標(biāo)記的MC-I抑制劑[4]、鏻正陽離子化合物[5]、季銨類陽離子化合物[2]等都以線粒體為靶標(biāo)，實現(xiàn)其在心肌中的聚集。其中，以三苯基膦為母體的18F標(biāo)記的親脂性鏻正陽離子可通過被動擴散進(jìn)入細(xì)胞，并利用跨膜電位可以富集于線粒體中[5-6]。但目前已報道的18F標(biāo)記的親脂性鏻正陽離子化合物的制備時間都比較長、且產(chǎn)率低，并普遍存在肝攝取高、非靶組織清除慢的缺點[6-8]。為研制生物性能優(yōu)良，適于臨床使用的新型18F標(biāo)記的親脂性鏻正陽離子心肌灌注顯像劑，本工作采用有甲氧基修飾的三-(2,6-二甲氧基苯基)膦為母體，以1,3-二(溴甲基苯)為標(biāo)記前體，一鍋標(biāo)記法制備得到3-氟-18F-甲基芐基-三-(2,6-二甲氧基苯基)鏻正陽離子(18F-2)，并對其進(jìn)行了生物性能的初步評價研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1,3-二溴甲基苯：純度>97%，Alfa Aesar；二水合氟化鉀：純度99%，天津化學(xué)試劑廠；Kryptofix2.2.2.(K2.2.2)：Sigma-Aldrich；無水碳酸鉀：純度99%，北京化工廠；18-Crown-6：純度99%，安耐吉化學(xué)有限公司；三(2,6-二甲氧基苯基)膦：純度>97%，Alfa Aesar；其余化學(xué)試劑為分析純，購自北京化工廠。

Avance 400型核磁共振譜儀：瑞士Bruker公司；高壓液相色譜儀：LC-20AT,日本島津公司；WALLAC/WIZARD 1470γ自動計數(shù)儀：美國 PerkinElmer公司；RM-905a放射性活度計：中國計量科學(xué)研究院；反向C18制備柱：20 mm×250 mm，5 μm，SHIMADZU C18,日本島津；反向C18分析柱：4.6 mm×250 mm，5 μm，Venusil MP-C18，美國Agela Technologies Inc.。

1.2 3-氟甲基芐基-三-(2，6-二甲氧基苯基)鏻鹽(19F-2)的合成

對照品3-氟甲基芐基-三-(2，6-二甲氧基苯基)鏻鹽(19F-2)的合成路線示于圖1。

在100 mL的三頸瓶中，無水，氮氣保護(hù)下，依次加入KF·2H2O (0.336 g，3.6 mmol)，無水乙腈10 mL，并在110 ℃下氮氣吹干，反復(fù)加入無水乙腈(10 mL×2)并用氮氣流吹干，殘余物冷卻到60 ℃，依次加入無水乙腈30 mL，18-Crown-6的無水乙腈溶液(0.966 g，3.66 mmol) 5 mL和1,3-二溴甲基苯(0.792 g，3 mmol)，并在100 ℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)完成后，減壓除去乙腈，得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物經(jīng)過正相硅膠柱色譜分離純化(流動相：石油醚)，得到無色1-氟甲基-3-溴甲基苯(19F-1) 0.25 g。產(chǎn)品無需純化直接投入下步反應(yīng)。

圖1 18F/19F-2的合成路線圖Fig.1 Synthesis routes of 18F/19F-2

另取100 mL的三頸瓶，氮氣保護(hù)下，加入無水乙腈20 mL，19F-1(0.061g，0.29 mmol)，溶解后緩慢滴加(2,6-二甲氧基苯基)三苯基膦(0.102 g，0.23 mmol)的無水乙腈溶液20 mL，氮氣保護(hù)下 100 ℃反應(yīng)10 h。反應(yīng)完成后，冷卻到室溫，減壓濃縮母液，粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化(淋洗液：V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1)，得到白色固體化合物3-氟甲基芐基-三-(2，6-二甲氧基苯基)鏻鹽(19F-2)0.06 g，其產(chǎn)率為37%，產(chǎn)品經(jīng)過氫譜和氟譜的鑒定：1H NMR(400 MHz, DMSO)δ:3.57(s,18H)，4.79～4.84(d,2H,J=20 Hz)，5.12(s,1H)，5.24(s,1H)，6.66～6.69(m,6H,J=12 Hz)，7.07～7.13(m,4H,J=28 Hz)，7.48～7.53(d,3H,J=20 Hz);19F NMR (400 MHz,DMSO)δ:-205.18。

1.3 3-氟-18F-甲基芐基-三-(2,6-二甲氧基苯基)鏻鹽(18F-2)的制備

18F-2采用一鍋法制備，其制備路線如圖1所示。將1.3 mL含有1.5 mg K2CO3和1 mg K2.2.2的18F-F-溶液加至10 mL反應(yīng)瓶中，110 ℃氮氣吹干，然后加入0.5 mL無水乙腈后再次110 ℃氮氣吹干，并重復(fù)該步驟三次。將3 mg 1,3-二溴甲基苯的無水乙腈溶液0.5 mL加入上述反應(yīng)瓶中，100 ℃密閉條件下反應(yīng)6 min，得到18F-1。冷卻至室溫再加入8 mg(2,5-二甲氧基苯基)三苯基膦的無水乙腈溶液0.5 mL，密閉條件下100 ℃反應(yīng)15 min，得到示蹤劑18F-2的粗產(chǎn)物。冷卻至室溫，過0.22 μm的濾膜，用乙腈稀釋至1 mL，充分混合后注入C-18 反相半制備柱(20 mm×250 mm)。收集保留時間為20～22 min的組分，氮氣吹干后，溶解于1 mL滅菌注射用水中，即為示蹤劑18F-2。HPLC淋洗梯度為等濃度淋洗，V(0.02 mol/L PBS)∶V(乙腈)=60∶40，流速：8 mL/min。

經(jīng)分離純化后標(biāo)記物的放化純度可通過C-18 反相分析柱 (4.6 mm×250 mm)鑒定。HPLC淋洗梯度為等濃度淋洗，V( 0.02 mol/L PBS)∶V(乙腈)=60∶40，流速：1 mL/min。

1.4 標(biāo)記化合物18F-2的體外穩(wěn)定性

1.4.1標(biāo)記化合物18F-2在水溶液中的穩(wěn)定性 將上述HPLC分離純化后的18F-2標(biāo)記物溶液于室溫放置3 h，依上述方法通過HPLC測定其放化純度，觀察標(biāo)記物18F-2在室溫水溶液條件下的體外穩(wěn)定性。

1.4.2標(biāo)記化合物18F-2在血清中的穩(wěn)定性 取上述HPLC分離純化后的18F-2標(biāo)記物溶液1～2 MBq/0.1 mL于0.5 mL 新鮮制備的小鼠血清中，37 ℃孵育3 h，加入0.5 mL乙腈，充分混勻后14 000 r/min離心5 min。上清液通過0.22 μm濾膜過濾后，依上述方法通過HPLC測定其放化純度，觀察標(biāo)記物18F-2在37 ℃條件下小鼠血清中的穩(wěn)定性。

1.5 標(biāo)記化合物18F-2的脂水分配系數(shù)和電荷的測定

1.5.1脂水分配系數(shù)的測定 參考文獻(xiàn)[9]，將0.1 mL(約1.11 MBq，放化純度>95%)的18F-2標(biāo)記溶液加入含2 mL正辛醇和1.9 mL 磷酸緩沖溶液(pH7.4,0.025 mol/L)的離心試管中，用振蕩器振蕩5 min后高速離心5 min，分別取有機相和水相各0.2 mL于干凈的試管中，在計數(shù)器上測其放射性活度，分配系數(shù)logPO/W=log(N有/N水)(N有和N水分別為有機相和水相樣品的計數(shù)率)，重復(fù)本操作3次，取平均值。

1.5.2電荷性質(zhì)測定 采用電泳實驗方法[9]，溶液介質(zhì)選用磷酸緩沖溶液(PBS，pH=7.4,0.052 5 mol/L)，電泳紙條選用新華一號紙(10 cm×1 cm)，將電壓調(diào)節(jié)在150 V，通電2 h后測定電泳條的放射性分布，判定標(biāo)記化合物18F-2的電荷性質(zhì)。

1.6 小鼠體內(nèi)的生物分布

取體質(zhì)量為18～20 g的正常昆明小鼠(由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)20只，分為4組，每組5只，每只動物尾靜脈注射0.1 mL18F-2標(biāo)記溶液(1.85 MBq/mL,放化純度>95%)，分別于注射后5、30、60、120 min時斷頸處死，取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨和血等組織和器官，稱重并在計數(shù)器上測其放射性活度，計算每克組織的放射性占總注射劑量的百分?jǐn)?shù)(%ID/g)，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)記配合物的制備及穩(wěn)定性研究

標(biāo)記化合物18F-2的制備通過兩步法得到，首先是18F-通過親核取代與1,3-二溴甲基苯反應(yīng)得到標(biāo)記中間體18F-1。18F-1并未進(jìn)行HPLC純化分離，而是直接采用一鍋法與三(2,6-二甲氧基苯基)膦反應(yīng)得到標(biāo)記產(chǎn)物18F-2，最后進(jìn)行HPLC分離純化。其總的標(biāo)記時間小于60 min，校正后的產(chǎn)率為(31±3)%，放化純度98%，比活度為30 GBq/μmoL。

標(biāo)記產(chǎn)物18F-2的HPLC分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，18F-2的保留時間為11.71 min，與其對照品19F-2 HPLC的UV檢測器保留時間基本一致(tR=11.69 min)。18F-2在室溫水溶液中和37 ℃條件下小鼠血清中孵育3 h后，HPLC分析未見其他放射性分解產(chǎn)物的生成，其放化純度仍大于95%，表明這18F-2具有良好的體外穩(wěn)定性。

a—對照品19F-2的UV檢測器HPLC譜圖；b—18F-2的放射性檢測器HPLC譜圖； c— 18F-2在室溫水溶液中孵育3 h后的HPLC分析譜圖；d—18F-2在37 ℃條件下小鼠血清中孵育3 h后的HPLC分析譜圖 圖2 HPLC分析譜圖Fig.2 The analysis trace by HPLC

2.2 標(biāo)記配合物的理化性質(zhì)

電泳實驗結(jié)果顯示，標(biāo)記化合物18F-2的放射性集中在負(fù)極，說明與預(yù)期設(shè)計一致，為帶正電荷的陽離子化合物，脂水分配系數(shù)logPO/W=1.82±0.01，表明其為脂溶性化合物。

2.3 生物分布

標(biāo)記化合物18F-2在正常昆明小鼠的體內(nèi)分布實驗結(jié)果列于表1。從表1中數(shù)據(jù)可以看出，標(biāo)記化合物18F-2在心肌的初始攝取很高且滯留較好，注射后5 min的心肌攝取為(53.88±7.45)%ID/g，給藥后120 min，心肌攝取仍然達(dá)到(25.36±1.44)%ID/g。其他非靶器官，例如肝臟中5 min時的攝取為(166.74±8.87)%ID/g，60 min時只有(5.99±0.94)%ID/g，清除率為96%；肺中5 min時的攝取為(40.73±7.59)%ID/g，60 min時只有(6.29±1.35)%ID/g，清除率為85%；血液中5 min時的攝取為(23.25±3.74)%ID/g，60 min時只有(2.61±0.69)%ID/g，清除率為87%。在肝、肺、血中的快速清除使得標(biāo)記化合物18F-2在注射后60 min的心與肝、心與肺和心與血放射性攝取比達(dá)到3.99、3.80和9.17。

表1 標(biāo)記化合物18F-2在正常小鼠中的生物分布Table 1 The biodistribution of 18F-2 in mice at 5, 30, 60, and 120 min after injection n=5)

另外，18F-2在小鼠腎臟中有很高的攝取和滯留，給藥后120 min時仍然達(dá)到(121.01±24.43)%ID/g，這說明18F-2在可能是經(jīng)過腎臟進(jìn)行代謝的。此外，19F-2在5 min之后骨的攝取明顯增加，說明這個放射性示蹤劑在體內(nèi)不穩(wěn)定，有明顯的脫氟現(xiàn)象。

目前已報道的18F標(biāo)記的且被廣泛研究的PET心肌灌注顯像劑主要分為兩大類，一類是18F標(biāo)記的噠嗪酮類衍生物，這類化合物具有代表性的是BMS747158-02以及18F-FP2OP。BMS747158-02是一個脂溶性的化合物， 與心臟內(nèi)的 MC-I 靶向結(jié)合，同時在體內(nèi)和體外都有很好的穩(wěn)定性，在多種物種體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物性能，目前BMS-747158-02 PET心肌灌注示蹤劑已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅲ期實驗[4]。18F-FP2OP為電中性脂溶性的化合物，具有成為PET心肌灌注顯像劑的潛力。該示蹤劑在小鼠中有很高的心肌攝取，注射后2 min，初始心肌攝取為(41.90±4.52)%ID/g，靶與非靶比較高，在初始 2 min 時，18F-FP2OP的心與肝、心與肺和心與血放射性攝取比分別為6.83、9.49和35.74。中華小型豬的PET顯像表明，心肌輪廓在注射后 5 min、 15 min、30 min和60 min時都很清晰。盡管[18F]FP2OP的心肌灌注顯像效果很好，但體內(nèi)外的穩(wěn)定性較差，因此還需要進(jìn)一步的研究[4]。另一類是18F標(biāo)記的親脂性陽離子類化合物，具有代表性的是18F標(biāo)記的三苯基鏻正陽離子心肌灌注顯像劑。由于線粒體具有高達(dá)180 mV的跨膜電位，該類示蹤劑親脂性可以使其以被動擴散的方式穿過膦脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞，然后通過線粒體的跨膜電位富集于線粒體而在心肌濃集[9]。其中以18F-FTPP和18F-FBnTP研究的最為深入，但存在制備步驟多、合成時間長、標(biāo)記產(chǎn)率低、肝本底偏高、清除緩慢的缺點。例如，18F-FTPP的合成時間大約2 h，衰變校正后產(chǎn)率約為10%[7]；18F-FBnTP的制備需要4步反應(yīng)且操作復(fù)雜，總的合成時間大約為82 min，衰變校正后產(chǎn)率約僅有6%[8]。對于18F-FTPP來說，其大鼠生物分布和大鼠顯像表明，該化合物心臟攝取很快，且有很穩(wěn)定的滯留，可以持續(xù)至少1 h。因此大鼠注射18F-FTPP后1 h的心臟攝取可以達(dá)到1.57%ID/g，而心與血、心與肺和心與肝放射性攝取比分別為75、4和8，未進(jìn)行更深入的研究。18F-FBnTP在顯像方面其表現(xiàn)出了更好的生物性能，屬于代謝穩(wěn)定的示蹤劑，其在體內(nèi)僅有很小的脫氟現(xiàn)象。18F-FBnTP因其快速的無創(chuàng)傷檢測和灌注缺損評價的靈敏度將會成為最有潛力的心肌灌注顯像劑。但是二者繁瑣的合成步驟和較低的放化產(chǎn)率導(dǎo)致臨床推廣受到極大的限制[6,9]。而本研究所采用的一鍋法標(biāo)記策略，使得標(biāo)記過程得以簡化，縮短了反應(yīng)時間，同時標(biāo)記率也大幅提高，成功制備了18F-FMBTP以及18F-mFMBTP[9]，本研究成功制備了示蹤劑18F-2，有利于進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

與不含取代基的三苯基鏻正陽離子心肌灌注顯像劑、如18F-FBnTP相比，甲氧基的引入使得示蹤劑在肝中的攝取顯著降低。給藥后60 min，18F-FBnTP在肝中的攝取為(8.09±3.9)%ID/g，心與肝攝取比1.50[10]；而18F-2給藥后60 min的肝攝取值為(5.99±0.94)%ID/g，心與肝攝取比可到達(dá)3.99，為18F-FBnTP的兩倍，有利于得到清晰的顯像效果。與18F-FMBTP以及18F-mFMBTP相比，在三苯基膦部分采用甲氧基進(jìn)行修飾可以增加該類示蹤劑的初始心肌攝取，如在小鼠體內(nèi)注射后2 min，18F-2的心肌攝取為(53.88±7.45)%ID/g，遠(yuǎn)高于18F-FMBTP的(25.24 ± 2.97)%ID/g以及18F-mFMBTP的(31.02 ± 0.33)%ID/g。在經(jīng)甲氧基修飾之后18F-2的肝清除速率也高于18F-FMBTP以及18F-mFMBTP，在30 min，60 min和120 min，18F-2的肝清除率分別為 91%， 96%， 98%，優(yōu)于18F-FMBTP的57%，84%，94%以及18F-mFMBTP的57%，84%，93%[9]。盡管18F-2具有較高的心肌攝取，以及較快的非靶組織清除性能，但同時也存在體內(nèi)穩(wěn)定性差，嚴(yán)重的脫氟現(xiàn)象導(dǎo)致骨攝取高的缺點。這可能是由于18F-2分子中在苯環(huán)鄰位為甲氧基，與不經(jīng)修飾的18F-FBnTP、18F-FTPP、18F-FMBTP和18F-mFMBTP相比，甲氧基的推電子作用，以及整個分子的共軛效應(yīng)導(dǎo)致C-F鍵不穩(wěn)定[9]，18F-2小鼠體內(nèi)的骨攝取隨著注射后時間的增加逐漸增加。這說明三苯基膦苯環(huán)取代基的數(shù)量、位置和性能對三苯基鏻正陽離子類心肌灌注顯像劑的生物性能有較大影響。但是18F-FMBTP和18F-mFMBTP在大鼠以及比格犬中并沒有觀察到明顯的骨攝取，因此18F-2小鼠體內(nèi)骨攝取的異常情況還需要在后續(xù)工作中進(jìn)行更深入的研究。

3 結(jié)論

通過一鍋法制備得到了一種含甲氧基的新型18F標(biāo)記的鏻正陽離子心肌灌注顯像劑18F-2。該標(biāo)記化合物為脂溶性配合物，具有很高的放化純度(>95%)和較好的體外穩(wěn)定性。 初步的生物性能研究結(jié)果顯示，18F-2具有較高的心肌初始攝取和良好的滯留，且在肝、肺、血等非靶組織中清除較快。這說明苯環(huán)取代基甲氧基的引入三苯基鏻正陽離子類心肌灌注顯像劑的生物性能有較大影響，利于肝、肺等非靶組織的清除，得到清晰的心肌灌注顯像。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步研制得到新的、性能優(yōu)良的三苯基鏻正陽離子類心肌灌注顯像劑奠定了一定的理論和實驗基礎(chǔ)。

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