鬼針草化學(xué)成分研究

王曉宇+陳冠儒+鄧子云+趙杰+葛金芳+李寧+陳飛虎

[收稿日期] 2013-10-17

[基金項(xiàng)目] 國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX0912-386）

[通信作者] *陳飛虎，Tel：（0551）65161116，E-mail：cfhchina@sohu.com；*李寧，Tel：（0551）65161115，E-mail：ln0110@sina.com

[作者簡介] 王曉宇，碩士研究生，Tel：13739250818，E-mail：wxy891017@163.com

[摘要] 對鬼針草Bidens bipinnata中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，篩選具有抗肝纖維化活性單體。采用大孔樹脂、硅膠、MCI樹脂、Sephadex LH-20等方法進(jìn)行分離純化，得到15個(gè)化合物，并運(yùn)用波譜技術(shù)測試，鑒定其結(jié)構(gòu)為槲皮素（1），槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（2），紫云英苷（3），山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4），5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黃酮（5），7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮（6），（R/S）-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷（7），（R/S）-異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（8），6，7，3′，4′-四羥基橙酮（9），海生菊苷（10），6，7-二羥基香豆素（11），3-咖啡酸酰基-2-甲基-D-赤蘚糖酸-1，4內(nèi)酯（12），（7S，8R）苯并二氫呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（13），丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖-（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（14），（+）丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（15）。其中化合物8，13～15為首次從本屬植物中分離得到。在初步的活性篩選中化合物1，6有較強(qiáng)體外抑制肝星狀細(xì)胞增殖的能力；化合物1，2，6，7有較強(qiáng)體外抑制腹腔巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的能力。

[關(guān)鍵詞] 鬼針草；化學(xué)成分；抗肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；巨噬細(xì)胞

鬼針草Bidens bipinnata L.是菊科鬼針草屬一年生草本植物，在我國大部分地區(qū)均有分布。民間藥用歷史悠久，具有有清熱解毒、涼血止血、散瘀、消腫等功效，主治感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肝炎及蛇蟲咬傷等。目前，各國學(xué)者對鬼針草屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行廣泛研究，其中主要包括黃酮類，聚乙炔類等成分。此外，本課題組前期藥理學(xué)研究也表明，鬼針草具有抗肝纖維化的功效，其總黃酮提取物對于小鼠肝損傷以及大鼠肝纖維化均有保護(hù)作用^[1-3]。為了更大程度的利用鬼針草藥材，得到具有抗肝纖維化活性的具體成分，本實(shí)驗(yàn)對鬼針草總黃酮提取物化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離，并且將得到的化合物進(jìn)行體外抗肝星狀細(xì)胞增殖以及抑制腹腔巨噬細(xì)胞生成腫瘤壞死因子TNF-α和 IL-1的活性研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用鬼針草提供依據(jù)。

1 材料

AM-400，DRX-500型核磁共振光譜儀（瑞士Bruker公司，四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)）；Agilent 1260-6224液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；HPD 100大孔樹脂（河北寶恩公司）；Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences公司）；MCI（日本Mitsubishi Chemical公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜GF254硅膠板（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）；肝星狀細(xì)胞HSC-T6（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院）；小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7（中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；LPS（美國Sigma）；Elisa試劑盒（美國R&D公司）；DMEM和FBS（美國Hyclone）。鬼針草采集于安徽省績溪縣，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室張群林教授鑒定，屬于菊科鬼針草屬鬼針草B. bpinnata，標(biāo)本號為JX053。

2 方法

2.1 提取分離 55 kg鬼針草干燥全草，用70%乙醇提取2次，提取液蒸發(fā)至無醇味，過HPD 100大孔樹脂，分別用3倍柱體積雙蒸水和70%乙醇作為洗脫劑，收集70%乙醇洗脫部分，蒸干，得到浸膏1.8 kg。浸膏用水分散，再次過HPD 100大孔樹脂，采用10%～100%乙醇進(jìn)行洗脫，共得到5個(gè)部分，B1～B5。B3（280 g）部分用硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 10∶1～1∶1）梯度洗脫得到7個(gè)部分，B3-1～B3-7。B3-1 經(jīng)過Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫、硅膠色譜（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶1）梯度洗脫得到化合物11（6 mg），12（10 mg）。B3-2經(jīng)過Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-2-1～B3-2-6；B3-2-1采用Sephadex LH-20（100%乙醇）得到化合物6（55 mg）；B3-2-6經(jīng)過MCI（30%～100%甲醇）得到化合物15（54 mg）。B3-4經(jīng)過Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-4-1和B3-4-8；B3-4-1采用硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 5∶1～1∶1）分離純化，得到化合物8（10 mg），13（25 mg）；B3-4-5 采用硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶5）進(jìn)行梯度洗脫得到化合物4（8 mg）。B3-6采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-6-1～B3-6-7；B3-6-1采用凝膠（100%乙醇）純化得到化合物14（100 mg）；B3-6-2和B3-6-7均采用MCI（0～100%甲醇）分別得到化合物7（27 mg），9（23 mg）。B3-6-4采用MCI（0～100%甲醇）以及反復(fù)的硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 20∶1～4∶1）純化得到化合物2（25 mg）。B3-7采用硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 20∶1～1∶1）得到B3-7-1～B3-7-10；B3-7-1采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到化合物1（45 mg）；B3-7-3先后采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）以及MCI（30%～100%甲醇）得到化合物3（20 mg），5（17 mg），10（23 mg）。endprint

2.2 四甲基偶氮唑法（MTT） HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的細(xì)胞（5×103細(xì)胞/孔）接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁加入不同濃度化合物（200，100，50，25，12.5 μmol·L^-1），每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后棄去上清。每孔加入20 μL濃度為5 g·L^-1的MTT和180 mL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清。加入150 mL的DMSO，震蕩后用酶標(biāo)儀在波長490 nm測吸光度，重復(fù)3次。

2.3 IL-1和TNF-α含量測定 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞（1×105細(xì)胞/孔）接種于24孔板中，培育養(yǎng)2 h后用分別加入LPS（1 mg·L^-1）和不同濃度化合物（100，10，1 μmol·L^-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液的上清液于4 ℃，3 000 r·min^-1離心10 min，-20 ℃保存待測。IL-1和TNF-α含量測定按ELISA試劑盒給定的步驟進(jìn)行操作。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.034 5[M-H]-（C15H9O7，計(jì)算值301.035 4）； 1H-NMR（CD₃COCD₃，400 MHz）δ：7.82（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.69（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6′），6.99（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.52（1H，d，J=1.6 Hz，H-8），6.26（1H，d，J=1.6 Hz，H-6）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：146.9（C-2），136.7（C-3），176.5（C-4），157.8（C-5），99.2（C-6），165.1（C-7），94.5（C-8），162.3（C-9），104.1（C-10），123.7（C-1′），115.8（C-2′），145.9（C-3′），148.4（C-4′），116.3（C-5′），121.5（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道槲皮素的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物2 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+ （C21H20NaO11，計(jì)算值471.089 8）； 1H-NMR（CD₃OD，400 MHz）δ：7.33（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.30（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），6.91（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.36（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），6.19（1H，d，J=1.9 Hz，H-6），5.35（1H，br s，H-1″），4.22～3.69（4H，m，H-2″～5″），0.93（3H，d，J=6.6 Hz，H-6″）。以上數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物3 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+（C₂₁H₂₀NaO₁₁，計(jì)算值471.089 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.04（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.88（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.43（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.46（1H，d，J=7.3 Hz，H-1″），3.57（1H，d，J=11.4 Hz，H-6″a），3.33（1H，m，H-6″b），3.41～3.09（4H，m，H-2″～5″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道紫云英苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物4 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 455.094 9[M+Na]+（C21H20NaO10，計(jì)算值471.094 9）； 1H-NMR（CD₃COCD₃，400 MHz）δ：7.86（2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），7.02（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.47（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.27（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.54（1H，d，J=1.2 Hz，H-1″），4.22～2.20（4H，m，rha-H），0.90（3H，d，J=5.7 Hz，6″-CH3）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：158.0（C-2），135.7（C-3），179.3（C-4），163.2（C-5），99.6（C-6），165.0（C-7），94.6（C-8），160.9（C-9），105.8（C-10），122.6（C-1′），131.7（C-2′，6′），116.3（C-3′，5′），158.5（C-4′），102.7（C-1″），71.5（C-2″），72.2（C-3″），73.0（C-4″），71.4（C-5″），17.8（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物5 黃色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.55（1H，d，J=7.4，2.0 Hz，H-6′），7.54（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.08（1H，d，J=7.4 Hz，H-5′），6.95（1H，s，H-8），5.13（1H，d，J=7.12 Hz，H-1″），3.86（3H，s，4′-OMe），3.80（3H，s，3-OMe），3.77（3H，s，6-OMe），3.74（1H，m，H-6″a），3.51（1H，m，H-6″b），3.49（1H，m，H-5″），3.36（2H，m，H-2″，3″），3.23（1H，m，H-4″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：178.6（C-4），156.7（C-2），156.2（C-7），152.3（C-5），151.5（C-9），150.6（C-4′），146.5（C-3′），138.2（C-3），132.4（C-6），122.4（C-1′），120.8（C-6′），115.3（C-2′），112.0（C-5′），106.5（C-10），100.3（C-1″），94.3（C-8），77.4（C-3″），76.9（C-5″），73.4（C-2″），69.8（C-4″），60.9（C-6″），60.6（4′-OMe），60.0（3-OMe），55.9（6-OMe）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黃酮數(shù)據(jù)基本一致。endprint

化合物6 黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 311.052 2[M+Na]+（C₁₅H₁₂NaO₆，計(jì)算值311.052 6）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.17（1H，d，J=8.6 Hz，H-6′），6.94（1H，s，H-2′），6.80（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.75（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.52（1H，d，J=8.6 Hz，H-6），5.38（1H，dd，J=11.8，2.8 Hz，H-2），3.03（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3），2.68（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：79.2（C-2），43.5（C-3），190.7（C-4），117.4（C-5），109.7（C-6），152.5（C-7），132.9（C-8），151.2（C-9），114.5（C-10），130.2（C-1′），114.4（C-2′），145.2（C-3′），145.6（C-4′），115.3（C-5′），118.0（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物7 白色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 473.105 1[M+Na]+（C₂₁H₂₂NaO₁₁，計(jì)算值473.105 4）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.23（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），6.92（1H，s，H-2′），6.86（1H，d，J=8.9 Hz，H-6），6.77（1H，s，H-6′），6.75（1H，s，H-5′），5.39（1H，dd，J=12.4，3.2 Hz，H-2），3.71（1H，d，J=8.0 Hz，H-6″a），3.48（1H，m，H-6″b），3.40～3.16（4H，H-2″～5″），3.11（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3a），2.69（1H，dd，J=17.0，2.8 Hz，H-3b）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：79.3（C-2），43.5（C-3），191.2（C-4），118.0（C-5），109.0（C-6），150.5（C-7），135.2（C-8），150.8（C-9），116.6（C-10），129.9（C-1′），114.5（C-2′），145.7（C-3′），145.2（C-4′），115.3（C-5′），116.4（C-6′），101.5（C-1″），73.2（C-2″），75.7（C-3″），69.7（C-4″），77.3（C-5″），60.7（C-6″）。核磁譜圖顯示為一組同分異構(gòu)體，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]中報(bào)道異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致，且異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷僅有一個(gè)2位碳為手性中心，因此可確定該組化合物結(jié)構(gòu)為異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（7a），異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖（2S）（7b）。

化合物8 白色粉末；1H-NMR（CD₃COCD₃，300 MHz）δ：7.58（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），7.28（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.1（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=4.4 Hz，H-5′），6.62（1H，d，J=8.7 Hz，H-6），5.55（1H，dd，J=12.9，2.9 Hz，H-2），4.78（1H，dd，J=7.3 Hz，H-1″），3.91（1H，d，J=3.0 Hz，H-OMe），3.58（1H，m，H-6″a），3.46（1H，m，H-6″b），3.34～3.14（4H，H-2″～ 5″），3.05（1H，m，H-3a），2.77（1H，m，H-3b）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：81.1（C-2），44.7（C-3），190.7（C-4），124.6（C-5），111.1（C-6），156.5（C-7），134.0（C-8），157.9（C-9），115.8（C-10），131.5（C-1′），111.3（C-2′），147.8（C-3′），148.5（C-4′），116.1（C-5′），120.2（C-6′），107.0（C-1″），75.0（C-2″），77.4（C-3″），71.0（C-4″），78.1（C-5″），62.4（C-6″），56.5（3′-OCH3）。核磁譜圖顯示為一組同分異構(gòu)體，以上數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致，且異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷只有一個(gè)2位碳為手性中心，因此可確定此組化合物結(jié)構(gòu)為異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（8a），異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（8b）。

化合物9 橘紅色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.037 4[M-H]-（C15H9O7，計(jì)算值301.035 4）；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.45（1H，s，H-2′），7.37（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），7.11（1H，d，J=8.1 Hz，H-4），6.85（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.73（1H，d，J=8.3 Hz，H-5），6.61（1H，s，H-10）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：145.9（C-2），182.0（C-3），116.0（C-4），111.8（C-5），155.0（C-6），130.2（C-7），154.4（C-8），114.5（C-9），112.7（C-10），123.6（C-1′），118.4（C-2′），145.5（C-3′），148.0（C-4′），115.2（C-5′），124.6（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道6，7，3′，4′-四羥基橙酮的數(shù)據(jù)基本一致。endprint

化合物10 紅色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.34（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），7.18（1H，d，J=8.5 Hz，H-4），7.07（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.87（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.71（1H，s，H-10），4.94（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），3.72（1H，dd，J=10.7，4.3 Hz，H-6″a），3.49（1H，dt，J=11.8，5.9 Hz，H-6″b），3.40（1H，m，H-2″），3.40（1H，m，H-3″），3.32（1H，m，H-5″），3.21（1H，m，H-4″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道海生菊苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物11 黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 201.015 4[M+Na]+（C9H6NaO4，計(jì)算值201.015 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.84（1H，d，J=9.4 Hz，H-4），6.95（1H，s，H-5），6.68（1H，s，H-8），6.12（1H，d，J=9.4 Hz，H-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道6，7-二羥基香豆素的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物12 白色粉末；1H-NMR（CD₃COCD₃，400 MHz）δ：7.63（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.16（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），7.04（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6），6.87（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.32（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），5.34（1H，dd，J=4.2，0.8 Hz，H-3′），4.65（1H，dd，J=11.1，4.2 Hz，H-4a），4.32（1H，dd，J=11.1，0.8 Hz，H-4b），1.52（3H，s，5′-CH3）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：127.4（C-1），116.4（C-2），146.3（C-3），149.0（C-4），115.2（C-5），122.8（C-6），146.9（C-7），114.8（C-8），177.5（C-1′），73.1（C-2′），75.4（C-3′），70.2（C-4′），22.4（C-5′），166.5（CO）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道3-咖啡酸?；?2-甲基-D-赤蘚糖酸-1，4內(nèi)酯的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物 13 黃色粉末；[α]20D -16（c 0.05，MeOH）； HR-ESI-TOF-MS m/z 541.167 7[M+Na]+（C₂₆H₃₀NaO₁₁，計(jì)算值541.168 0）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：9.60（1H，d，J=7.8 Hz， H-9′），7.65（1H，d，J=15.7 Hz，H-7′），7.32（1H，s，H-2′），7.31（1H，s，H-6′），7.11（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.86（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6），6.72（1H，dd，J=15.7，7.8 Hz，H-8′），5.62（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），4.89（1H，d，J=7.4 Hz，H-1″），3.85（3H，s，3′-OMe），3.85～3.76（2H，m，H-9），3.75（3H，s，3-OCH3），3.68（1H，m，H-6″a），3.52（1H，d，J=6.0 Hz，H-8），3.43（1H，m，H-6″b），3.30～3.17（4H，m，H-2″～5″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：134.7（C-1），110.5（C-2），149.0（C-3），146.4（C-4），115.4（C-5），118.20（C-6），87.8（C-7），52.7（C-8），62.7（C-9），127.9（C-1′），112.7（C-2′），144.2（C-3′），150.7（C-4′），130.0（C-5′），119.0（C-6′），154.0（C-7′），126.2（C-8′），194.1（C-9′），100.0（C-1″），73.2（C-2″），76.9（C-3″），69.7（C-4″），77.0（C-5″），60.7（C-6″），55.8（5-OCH3），55.9（5′-OCH3）。并利用1H-1H COSY，HSQC和HMBC進(jìn)行碳?xì)湫盘枤w屬。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道（7S，8R）苯并二氫呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物14 黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 481.168 0[M+Na]+（C₂₁H₂₀NaO₁₁，計(jì)算值471.089 8）；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.00（1H，d，J=8.3 Hz，H-6），6.79（1H，d，J=1.6 Hz，H-3），6.69（1H，dd，J=8.3，1.6 Hz，H-5），5.94（1H，ddt，J=16.3，9.5，6.5 Hz，H-8），5.09（1H，d，J=1.6 Hz，H-9a），5.04（1H，d，J=1.6 Hz，H-9b），4.81（1H，d，J=3.0 Hz，H-1″），4.79（1H，d，J=7.4 Hz，H-1′），3.87（1H，d，J=9.4 Hz，H-4″a），3.85（1H，d，J=11.2，H-6′a），3.74（3H，s，2-OCH3），3.73（1H，m，H-2″），3.58（1H，d，J=9.4 Hz，H-4″b），3.45（1H，m，H-5′），3.41（1H，d，J=11.2 Hz，H-6′b），3.34（1H，m，H-5″），3.31（2H，m，H-7），3.25（1H，m，H-3′），3.24（1H，m，H-2′），3.08（1H，s，H-4′）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：145.0（C-1），149.0（C-2），115.7（C-3），133.5（C-4），120.5（C-5），113.0（C-6），39.2（C-7），137.9（C-8），115.5（C-9），100.5（C-1′），73.2（C-2′），76.8（C-3′），70.0（C-4′），75.5（C-5′），67.7（C-6′），109.3（C-1″），75.9（C-2″），78.7（C-3″），73.3（C-4″），63.1（C-5″），55.7（2-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。endprint

化合物15 白色粉末；[α]20D -38.5（c 0.1，MeOH）； HR-ESI-TOF-MS m/z 603.204 8[M+Na]+（C₂₈H₃₆NaO₁₃，計(jì)算值603.204 8）； 1H-NMR（CD₃OD，400 MHz）δ：6.72（ 2H，s，H-2，6 ），6.66（2H，s，H-2′，6′ ），4.85（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），4.77（1H，d，J=4.0 Hz，H-7），4.71（1H，d，J=4.0 Hz，H-7′），4.27（2H，m，H-9a，9′a），4.10（1H，d，J=7.1 Hz，H-1″），3.91（2H，d，J=9.4 Hz，H-9b，9′b），3.86（6H，s，3，3′-OCH₃），3.85（6H，s，5，5′-OCH₃），3.13（2H，m，H-8，8′）； 13C-NMR（CD₃OD，100 MHz）δ：136.9（C-1），106.8（C-2，6），155.9（C-3，5），140.9（C-4），89.1（C-7），57.2（C-8），74.4（C-9，9′），135.0（C-1′），106.3（C-2′，6′），150.9（C-3′，5′），137.2（C-4′），88.7（C-7′），57.0（C-8′），106.0（C-1″），77.2（C-2″），79.3（C-3″），72.8（C-4″），79.9（C-5″），64.1（C-6″），58.6（-OCH3），58.3（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道（+）-丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

4 藥理活性篩選

4.1 化合物對HSC-T6增殖的影響 利用MTT法測試分離得到的10個(gè)黃酮類化合物抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的能力，比較各黃酮化合物的IC50，其中表沒食子兒茶素兒茶酸脂（EGCG）為陽性藥。結(jié)果顯示化合物1～4，6，7有一定的抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的能力（表1）。其中槲皮素（1）和7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮（6）的抑制活性與陽性藥EGCG（43.52 μmol·L^-1）相當(dāng)。

4.2 黃酮類化合物對腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子含量的影響 對黃酮類化合物進(jìn)行了抗炎免疫活性篩選。采用Elisa法測定LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1的含量。結(jié)果顯示，10個(gè)化合物體外給藥均不同程度的降低細(xì)胞TNF-α和IL-1的產(chǎn)生，并隨濃度增高抑制率增強(qiáng)。其中化合物1，2，6，7抑制IL-1產(chǎn)生的效果最為明顯（表2）。

5 討論

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，鬼針草總黃酮提取物對各種原因誘導(dǎo)的肝纖維化均有治療作用。但目前鬼針草總黃酮中的化學(xué)組成仍不清楚，起到治療肝纖維化作用的成分尚不明確。本文從傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物分離方法入手，分離得到15個(gè)化合物，其中有10個(gè)為黃酮類化合物，含量較高。在這15個(gè)化合物中8，13～15為首次在該屬植物中分離得到的化合物。

肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，肝臟損傷時(shí)，HSC 受到各種致病因子的刺激，從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生^[18]。巨噬細(xì)胞在肝纖維化的過程中也很重要，其合成和釋放的細(xì)胞因子如TNF-α和白介素1，6，8等促肝纖維化細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的激活、增殖和膠原合成。本文在分離得到的化合物基礎(chǔ)上，著重研究含量較高的黃酮類化合物在體外對HSC-T6細(xì)胞增殖以及對巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放的炎癥因子的作用。

結(jié)果顯示，3′，4′鄰二羥基取代的黃酮和二氫黃酮類化合物1，2，6，7有較強(qiáng)的抑制HSC-T6增殖的活性，因此推測3′，4′鄰二羥基為抑制肝星狀細(xì)胞增殖的重要基團(tuán)；化合物2和7的活性又相對弱于1和6，因此推測，黃酮類化合物3，7位的羥基可能為抑制肝星狀細(xì)胞增殖的重要基團(tuán)。同樣，化合物1和6有較強(qiáng)的抑制RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子TNF-α和IL-1的能力，推測其活性可能也與3′，4′鄰二羥基有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)從鬼針草總黃酮第Ⅲ部分中分離得到15個(gè)化合物，經(jīng)過體外篩選得到2個(gè)活性較強(qiáng)的抗肝纖維化化合物。然而鬼針草總黃酮其余部分組分仍然未知，因此，還需要進(jìn)一步的分離以及篩選抗肝纖維化的化合物，得到更多活性更強(qiáng)的化合物。

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