消栓通絡(luò)片中水溶性成分的提取及質(zhì)量控制

葉曉萍

（惠州學(xué)院 化學(xué)工程系，廣東 惠州 516007）

引言

消栓通絡(luò)片是由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中藥組成，具有活血化瘀，溫經(jīng)通絡(luò)功效【1-2】。君藥川芎、丹參、郁金中含有水溶性酚酸類化合物［3-5］，其中原兒茶醛和咖啡酸具有廣泛的抑菌、抗病毒、擴(kuò)張心腦血管、抗血小板凝集作用，原兒茶醛清除氧自由基等作用較二萜醌類的丹參酮更強(qiáng)。消栓通絡(luò)片的非水溶性成分含量指標(biāo)已有報(bào)道［6-7］，但水溶性成分含量指標(biāo)至今沒此方面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。茍小鋒等用電化學(xué)色譜法對(duì)此進(jìn)行了研究［8］，但方法復(fù)雜且儀器昂貴。本研究利用TLC與PHLC，對(duì)消栓通絡(luò)片中主要水溶性藥效成分的提取及定性、定量方法進(jìn)行了研究，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、藥品

AgiLent1100液相色譜儀(安捷倫，紫外檢測(cè)器)；5HU系列超聲波清洗器(天津恒奧科技)；HL—01溶劑過濾器；高速離心機(jī)；PHS-3C酸度計(jì)；LD－10LG－E1超純水機(jī)。

咖啡酸、原兒茶醛（Sigma公司），甲醇（色譜純））；消栓通絡(luò)片（黑龍江天宏藥業(yè)，批號(hào)：20060201），乙醇、醋酸乙酯、乙醚、甲酸、甲苯、三氯化鐵、醋酸碳酸鈉（分析純）川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂（同仁堂）。

1.2 供試品溶液的提取

取消栓通絡(luò)片10片，去包衣研碎，加乙醇25mL，超聲30min，放冷過濾，濾液蒸干。殘?jiān)?5mL水溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至2～3，加適量醋酸乙酯，超聲波提取3次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液，再用2%碳酸鈉溶液超聲波提取3次，每次10mL，合并碳酸鈉提取液，用水飽和的乙醚20mL洗滌，棄去乙醚液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至2～3，用乙醚超聲波提取3次，每次15mL，合并乙醚提取液，揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1.0mL溶解后，作為供試品溶液1#，用于薄層色譜（TLC）定性分析。

取本品20片，去包衣，研細(xì)，稱重為2.0563g，加入甲醇10.0mL，稱重后超聲提取4次，每次1h，靜置過夜后用甲醇補(bǔ)足減失的重量，在3000r.min-1下離心15min，吸取上清液5.0mL于10mL量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜過濾，即得供試品溶液2#，用于高效液相（HPLC）定量定性分析。

取本品5片，除去包衣，研碎，加甲醇30mL，超聲30分鐘，放冷過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5mL使溶解，用醋酸乙酯振搖提取2次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液3#質(zhì)，TLC定性分析和HPLC定量定性分析。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

取兩份原兒茶醛對(duì)照品適量，一份加入無水乙醇制成質(zhì)量濃度為0.5000g.L-1原兒茶醛對(duì)照品溶液1#用于TLC定性分析；一份加入甲醇制成質(zhì)量濃度為0.0803g.L-1原兒茶醛對(duì)照品2#溶液，再取咖啡酸對(duì)照品加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.0200g.L-1的咖啡酸對(duì)照品溶液，兩者均用于HPLC定量定性分析。

1.4 陰性樣品溶液的提取

按方抓取川芎、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十味藥材，將冰片和三七各粉碎成細(xì)粉；其余八味加水煎煮三次，合并煎液，過濾，濾液水浴濃縮成清膏，加入三七粉，烘干，制成粉末，干燥，再加入冰片粉，混勻，即得陰性樣品粉未。將陰性樣品粉未按供試品溶液1#制法制成陰性樣品溶液1#，用于TLC定性分析。再取陰性樣品粉末約2g照供試品溶液2#的提取制備方法制備成陰性樣品溶液2#，HPLC定量定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLC法的定性鑒別

吸取1.2～1.4項(xiàng)下的所有1#溶液各10mL，在25oC、濕度65%下分別點(diǎn)于同一硅膠G薄板上，以甲苯：醋酸乙酯：甲酸（10：5：0.5）為展開劑，展開后取出晾干，噴以1%三氯化鐵-乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，如圖1。從圖1知，各成份斑點(diǎn)清晰、分離度好。在供試品色譜A與對(duì)照品色譜B相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，但在與陰性樣品色譜C相應(yīng)位置上未發(fā)現(xiàn)任何斑點(diǎn)；吸取供試品溶液3#、咖啡酸對(duì)照品和陰性對(duì)照品溶液1#各5mL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）為展開劑，展開，取出晾干，置紫外燈光（365nm）下檢視。結(jié)果表明，展開顯色后，各有效成份斑點(diǎn)清晰、分離度好。在供試品色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而在陰性樣品色譜中相應(yīng)位置上未發(fā)現(xiàn)任何斑點(diǎn)（圖略）。說明消栓通絡(luò)片中含有原兒茶醛、咖啡酸，且來都自于丹參，無陰性干擾。

Fig.1 TLC chromatograms of XiaoShuanTongLuo tabLets（A），protocatechuaLdehyde reference substances（B）and Negative sampLes withouts Danshen（c）

2.2 HPLC法對(duì)消栓通絡(luò)片定量方法

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

在波長(zhǎng)為280nm下，分別在0.1%～2.5%冰醋酸：甲醇＝85：15的六種流動(dòng)相下測(cè)定對(duì)照品溶液2#。結(jié)果原兒茶醛的保留時(shí)間隨酸度增大依次縮短，峰的對(duì)稱度增大；在波長(zhǎng)為320 nm下，以不同配比的甲醇：水：冰乙酸：三乙胺配為流動(dòng)相，測(cè)咖啡酸對(duì)照品溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入三乙胺可使峰的對(duì)稱度、分離度增大，而咖啡酸的保留時(shí)間隨酸度增大依次縮短。兩種系列都與C18柱的特點(diǎn)相結(jié)合考慮，最終選2.0%冰醋酸：甲醇＝85：15和甲醇：水：冰乙酸：三乙為11：89：2.0：0.3為流動(dòng)相。

2.2.2 柱溫的選擇

吸取對(duì)照品2#溶液10μL，在30℃～45℃下測(cè)定（圖2）。由圖2知40℃為最佳柱溫。同樣，咖啡酸對(duì)照品溶液10μL上述相同之處溫度下測(cè)定，結(jié)果是30℃時(shí)最佳（圖略）。

圖2不同柱溫下的原兒茶醛對(duì)照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances of coLumn temperature at 30℃（A），40℃（B）and 45℃（C）

2.2.3 流速的選擇

在流速為0.6～1.0(mL.min-1)下測(cè)試對(duì)照品2#溶液，發(fā)現(xiàn)它們的出峰時(shí)間漸短，考慮到消栓通絡(luò)片成分的復(fù)雜性及原兒茶醛要與其它成分有效分離等因素，確定流速為0.8mL.min-1，保留時(shí)間為10.963。同理測(cè)定咖啡酸對(duì)照品溶液的最佳流速為0.8mL.min-1，其保留時(shí)間為22.398min。

2.2.4 干擾性分析

吸取上述所有2#溶液，在原兒茶醛的色譜條件下測(cè)定，原兒茶醛對(duì)照品譜圖見圖2中A圖，樣品及陰性樣品圖見圖3。對(duì)比圖3和圖2（A），可確定譜圖3-A中保留時(shí)間為10.963的峰為原兒茶醛，而圖3-B中，原兒茶醛的保留時(shí)間內(nèi)沒有出峰。同樣，分別吸取上述咖啡酸對(duì)照品溶液、供試品溶液2#及陰性樣品溶液2#，在咖啡酸的色譜條件下測(cè)定，得圖4。觀察圖4，可確定圖4-B中保留時(shí)間為22.398 min的峰為咖啡酸，而圖4-C中，在咖啡酸的保留時(shí)間內(nèi)沒有出峰。綜上進(jìn)一步說明原兒茶醛和咖啡酸來自丹參，藥中其它成分無干擾，與相鄰的雜質(zhì)分離好。

圖3 供試品（A）陰性樣品（B）液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms XiaoShuanTongLuo tabLets sampLe（B）and Negative sampLes withouts Danshen（c）

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取原兒茶醛對(duì)照品2#溶液及咖啡酸對(duì)照品溶液各0.5、1、2、3、4、5、6、15、20μL，測(cè)定峰面積，外標(biāo)峰面積法得原兒茶醛回歸方程y=434314x+18625，在0.040～1.606μg內(nèi)呈線性；咖啡酸為y=200580x+15672，在0.010～0.400μg內(nèi)呈線性，相關(guān)系數(shù)均為0.9998。

2.2.6 供試品中原兒茶醛及咖啡酸含量的測(cè)定

取20片藥品，按1.2項(xiàng)下供試品溶液2#制備方法制備，吸取10μL溶液測(cè)定，得原兒茶醛含量為0.109 mg.g-1即0.011 mg/片，RSD=1.09% ，咖啡酸的含量為0.121 mg.g-1，即0.012 mg/片，RSD=0.85%，（n=3）。

2.2.7 精密度試驗(yàn)，穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品溶液2#和咖啡酸對(duì)照品溶液各20μL，在各自色譜條件下重復(fù)測(cè)定5次，原兒茶醛的RSD=0.12%，咖啡酸的RSD=0.57%；同理在0～48h內(nèi)每間隔3h測(cè)定供試品溶液2#一次，以便考查方法的穩(wěn)定性，結(jié)果原兒茶醛的RSD=1.22%，咖啡酸的RSD=0.53%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密移取供試品2#溶液各100μL，分別加入已加濃度為160.6ug.mL-1的原兒茶醛對(duì)照品及200.0ug.mL-1的咖啡酸對(duì)照品溶液各12μL，混勻，按2.2.6法測(cè)定，計(jì)算原兒茶醛平均回收率為100.46%，RSD=0.97%（n=5），咖啡酸平均回收率為99.84%，RSD=0.08%（n=5）。

3 結(jié)論

3.1 原兒茶醛具有酸性，在中性流動(dòng)相中因存在著離解平衡，使其色譜峰嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，加入少量醋酸可抑制其離解，減少拖尾。

3.2 采用薄層色譜法，以原兒茶醛為檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，考慮了不同醇沉濃度對(duì)原兒茶醛提取的影響。結(jié)果表明，用濃度為50%～60%的醇沉原兒茶醛損失較小，但用水作提取溶媒更有利于原兒茶醛的溶出，不過僅超聲30min提取原兒茶醛并不完全，而浸泡有利于原兒茶醛的溶出。即原兒茶醛水溶性成分提取工藝為：用水浸泡過夜再提取。溶劑pH對(duì)水溶性成分提取的有影響：隨著PH值升高，原兒茶醛含量顯著降低，在PH 9.2時(shí)已很微量；這表明，溶劑PH值是影響原兒茶醛提取效果的一個(gè)非常重要的因素。

3.3 本實(shí)驗(yàn)的TLC和HPLC法的專屬性強(qiáng)，二者能相互印證說明藥中其它成分對(duì)分離測(cè)定無干擾，消栓通絡(luò)片中的主要水溶性藥效原兒茶醛、咖啡酸均來自于丹參，川芎、郁金中不含有，所以工廠在生產(chǎn)時(shí)一定要注意丹參的采購質(zhì)量及其加工提取過程中的工藝控制。此研究方法簡(jiǎn)便可行，快捷，準(zhǔn)確度及靈敏度高，可用于工廠及藥監(jiān)部門做為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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